女贞子中还原糖提取工艺研究

郗艳丽，张洋婷，杜鹃，欧阳少枫，樊雪妮，魏振奇

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

女贞子中还原糖提取工艺研究

郗艳丽，张洋婷，杜鹃，欧阳少枫，樊雪妮，魏振奇

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

以女贞子为原料，对还原糖提取的影响因素及工艺进行研究。采用甲醇提的方法，分析提取温度、料液比、回流次数对女贞子还原糖提取含量的影响，采用DNS比色法测女贞子中还原糖的含量。在单因素基础上进行正交试验设计，筛选出最佳提取工艺。在提取温度为90℃、料液比为1∶60（g/mL）、回流次数8次的条件下，女贞子还原糖的提取含量最高，可达到262.30μg/mL，此时还原糖的提取率为5.246%。

女贞子；还原糖；正交试验；DNS检测法

女贞子为木樨科女贞的成熟干燥果实［1］，传统中医利用女贞子治疗肝肾不足所致的人体衰老、头晕耳鸣、须发早白以及腰膝酸软［2］。女贞子富含多种生物活性物质，如三萜类化合物［3］、皂苷［4］、蒽醌或其苷、黄酮或其皂苷［5］、挥发油以及酚类［6］，此外，女贞子还富含糖类或糖苷类物质［7］。女贞子中富含的糖类物质按照碳链长短可分为单糖、寡糖和多糖，按照有无还原性可分为还原糖和非还原糖。还原糖是指具有还原性的糖类，葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖和木糖等都是还原糖［8］。还原糖具有抗结晶性，这决定了其易溶于水或者有机溶剂，溶解度比非还原糖好［9］。女贞子中富含的还原糖主要包括葡萄糖和阿拉伯糖［7］：葡萄糖是机体的重要供能物质，能参与机体的基本功能，节约蛋白质并参与了解毒作用；阿拉伯糖具有降血糖［10］、降血脂［11］、润肠通便等作用［12］。此外，阿拉伯糖对B型和Q型烟粉虱有毒性作用，可以有效抑制烟粉虱对农作物的危害［13］。再者，阿拉伯糖有类似蔗糖的甜味，但可以抑制胃肠道对蔗糖的吸收，是许多国家公认的具有减缓体重增加以及减肥的功效，美国医疗协会已将其列入营养补充剂中以治疗肥胖［14］。目前市场上对与葡萄糖或阿拉伯糖类似的功能性糖的需求越来越高，阿拉伯糖的市场售价高达10万～20万美元/t［14］，葡萄糖的市场售价约为4万～5万人民币/t。无论是葡萄糖还是阿拉伯糖都具有广阔的市场空间，若能获得纯度较高的这两类功能性糖，必将创造巨大的经济价值。女贞子中虽富含葡萄糖和阿拉伯糖，但具体含量尚不十分清楚。本研究利用正交试验的方法优化了女贞子中还原糖的提取工艺，以DNS比色法检测女贞子提取物中粗还原糖的含量，为葡萄糖或者阿拉伯糖的分离提纯提供参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

女贞子：购于吉林市药房。

1.1.2试剂

葡萄糖：北京化工厂；3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠和无水亚硫酸钠均购于国药集团化学试剂有限公司；苯酚：天津盛通泰化工有限公司；氢氧化钠：西陇化工股份有限公司；石油醚：上海德榜化工有限公司，以上试剂均为国产分析纯。

1.1.3仪器

722型分光光度计：上海菁华科技有限公司；多功能粉碎机：中南制药机械厂；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯；电子天平：上海精密仪器设备有限公司；202-1型电热恒温干燥箱：天津泰森仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1提取工艺

女贞子干燥后粉碎，过100目筛子筛选粒度均匀的细颗粒，将细粉浸于石油醚中低温过夜，脱去脂肪。过滤法移除石油醚，置于通风橱中，待样品中石油醚完全挥发后，准确称重，索氏提取法提取，收集提取液并定容，DNS比色法检测提取物中还原糖含量。

1.2.2DNS法检测还原含量

1.2.2.1DNS的配置

准确称取3，5-二硝基水杨酸1.70 g，氢氧化钠5.25 g充分溶解于100 mL蒸馏水中，加入酒石酸钾钠45.50 g，苯酚1.25 g，无水亚硫酸钠1.25 g，搅拌至全溶，定容至250 mL，转移至棕色瓶备用。

1.2.2.2葡萄糖标准曲线的配置

精密称取葡萄糖0.10 g于烧杯中，加蒸馏水充分溶解后移入容量瓶并定容至100 mL，得到终浓度为1.00 mg/mL的葡萄糖标准溶液。取7支干净干燥试管，将葡萄糖标准溶液分别稀释到0、50、100、150、200、250、300 μg/mL，分别取各浓度葡萄糖标准溶液1 mL于试管中，加入2mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，加蒸馏水至10 mL并充分摇匀，在540 nm波长下测其吸光度（A）值。以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为y=0.026 4x+0.043 6，相关系数R2=0.999 8，在0 μg～300 μg范围内吸光度与葡萄糖标准品质量浓度呈良好线性关系。

式中：X为女贞子还原糖提取率，%；M1为根据回归方程计算女贞子中还原糖含量，μg；M2为用于测定的女贞子样品质量，g；V1为样品定容体积，mL；V2为移取待测提取液的体积，mL。

1.2.3女贞子还原糖提取效果的单因素试验

准确称取脱脂后的女贞子粉末0.50 g，加入甲醇后置于索氏提取器中回流提取制得提取液，加入甲醇定容后测定女贞子还原糖含量并计算提取率。分别以提取温度、回流次数和料液比3个因素为对象，考察其对女贞子还原糖提取含量和提取率的影响。

1.2.4女贞子还原糖提取的正交试验

在单因素试验基础上，选取对提取含量和提取率有较大影响的水平入选正交试验，以提取温度、回流次数和料液比3个因素3个水平进行L9（34）试验，优化女贞子还原糖提取的最佳工艺条件。正交试验因素水平表见表1。

1.2.2.3DNS法检测女贞子中还原糖提取率

将提取液按照1.2.2.2的步骤检测吸光度（A）值，根据标准曲线计算女贞子中还原糖的含量，带入下列公式计算还原糖的提取率。

表1　女贞子还原提取工艺优化正交试验因素水平表Table 1Factors and levels of orthofonal test of reducing sugar from Ligustrum lucidum Ait

1.2.5验证试验

精密称取0.50 g脱脂后的女贞子粉末，在1.2.4的条件下进行3次重复试验，验证最优条件的稳定性。

1.3数据统计及分析

使用graphPadPrism5.0软件进行数据统计和绘图。

2结果

2.1单因素的优化

2.1.1提取温度对女贞子还原糖提取含量的影响

提取温度对女贞子还原糖提取含量影响见图1所示。

图1　提取温度对女贞子还原糖含量的影响Fig.1Effect of extraction temperature on reducing sugar yield

由图1可知，随着提取温度的增加，还原糖提取含量逐渐增多，提取温度为90℃时女贞子中还原糖的提取含量最高，为152.60 μg/mL；随后，还原糖含量随着温度的增高逐渐降低，提取温度为100℃时女贞子还原糖的提取含量最少，为85.40 μg/mL。这可能与提取温度过高，有效成分的结构被破坏有关。此外，还原糖在高温条件下有效成分易失活。在还原糖生物活性无法保障的前提下，还原糖提取物丧失了应有的价值，因为只有具有较高生物学活性且稳定性好的还原糖提取物才具有开发的价值。较高的提取温度也不利于节能环保，提取成本也会增加。从试验结果可知提取温度为85、90、95℃这3个条件女贞子还原糖的提取含量最高。因此，选取这3个水平进入正交试验。

2.1.2料液比对女贞子还原糖提取含量的影响

料液比对女贞子还原糖提取含量的影响见图2所示。

图2　料液比对女贞子还原糖含量的影响Fig.2Effect of solid-liquid ratio on reducing sugar yield

甲醇是一种有毒的有机溶剂，且具有一定的挥发性，减少甲醇的使用量，并获得较高的还原糖提取效率是获得环境友好型产品的基本要求。此外，减少甲醇的使用量，可以满足降低生产成本的要求。优化料液比可以实现在获得最大还原糖提取含量的同时降低生产成本，还可减少成品中甲醇的残留，提高产品利用的空间。由图2可知，在称取相同质量女贞子粉末的情况下，当料液比为1∶50（g/mL）时，加入甲醇未能充分浸泡女贞子粉末，因此，不能充分浸提女贞子粉末中的还原糖。随着加入的甲醇逐渐增多，女贞子还原糖提取含量逐渐增加，在料液比为1∶60（g/mL）时，女贞子还原糖的提取含量最高，可达到206.43 μg/mL，这表明在料液比为1∶60时，加入甲醇的量能充分浸提女贞子粉末中的还原糖；随后，随着甲醇使用量逐渐增加，女贞子还原糖提取含量逐渐减少，当料液比达到1∶70时，女贞子还原糖含量降低，只有135.76 μg/mL，这表明甲醇的使用量增多，并不能提高女贞子粉末中还原糖的提取量，反而会因为甲醇使用量的增多，使还原糖提取含量降低。而甲醇使用量的增加会增加提取成本，增加了产品中甲醇残留的风险以及后续除尽甲醇的困难，不利于提取产品的推广和应用。因此选取还原糖提取含量较高且甲醇使用量较少的1∶55、1∶60、1∶65（g/mL）这3个水平进入正交试验。

2.1.3回流次数对女贞子还原糖提取含量的影响

回流次数对女贞子还原糖提取含量的影响见图3所示。

图3　回流次数对女贞子还原糖含量的影响Fig.3Effect of reflux times on reducing sugar yield

索氏提取法提取女贞子还原糖过程中，甲醇回流4次时已达到无色，满足检测要求。因此，对回流次数这个因素的分析从基础回流次数4次开始。由图3可知，从回流4次开始，随着提取过程中甲醇回流次数的增多，女贞子中还原糖提取含量逐渐增多，试验表明甲醇回流8次的提取含量最多，可达到139.98 μg/mL。这表明甲醇回流的次数越多，甲醇浸提女贞子粉末的时间就越长，对还原糖提取会越充分。提高回流提取次数，可以在较少甲醇使用量的情况下充分浸提还原糖，提高还原糖的提取含量，降低提取成本。与回流8次提取还原糖含量比较，回流提取次数为7次和6次时还原糖的含量减少，但比回流5次和4次时还原糖的提取含量高。因此，选取回流提取6次、7次和8次这3个水平进入正交试验。

2.2正交试验结果

根据单因素试验的结果，以提取温度、料液比和回流次数3个因素为考查因素，各取3个对女贞子还原糖提取含量影响较大的水平进行正交试验（正交试验表见表1），优化女贞子还原糖的提取工艺（优化结果见表2）。

表2　正交试验结果Table 2Results and range analysis of orthogonal test

由极差R值可知，极差的大小顺序为A＞C＞B，女贞子中还原糖的提取工艺影响因素主次顺序也为A＞C＞B，即索氏提取的温度对提取含量影响最大，回流次数次之，料液比最小。最佳组合条件为A2B2C3，即提取温度为90℃，料液比为1∶60（g/mL），回流次数为8次，在此条件下女贞子还原糖的提取含量最高，可达到259.74 μg/mL，提取率为5.19%。

2.3验证试验结果

为了进一步检测女贞子提取工艺的稳定性，精密称取1.00 g女贞子粉末，在上述最优条件下进行3次平行提取试验，测女贞子还原糖提取含量分别为266.83、261.66、258.41 μg/mL，平均值为262.30 μg/mL，这与正交试验中各组提取含量相比为最高值，这表明正交试验结果正确。用提取温度为90℃，料液比为1∶60（g/mL），回流次数为8次做为提取条件，女贞子还原糖的提取率均值为5.246%。验证性试验结果表明最优条件的提取工艺稳定，重复性好。

3结论

通过本研究发现，利用醇提法提取了女贞子中的还原糖，DNS法准确检测了提取物中还原糖的含量，通过工艺优化获得了含量较高的女贞子还原糖提取工艺。通过单因素试验和正交试验发现，影响女贞子还原糖提取含量的因素中，提取温度为主要影响因素，回流次数为次要影响因素，料液比对提取含量的影响最小。优化女贞子中还原糖的提取最佳工艺为提取温度为90℃，料液比为1∶60（g/mL），回流次数为8次，在此条件下女贞子还原糖的提取率为5.246%。本研究优化的提取工艺中，提取温度合适，没有因为过高的温度而导致还原糖活性降低；料液比的比例合适，在最少甲醇使用量的前提下，保障了提取效率以及较高的提取物活性；回流次数合理，在保障获取较多女贞子还原糖的前提下，缩短了提取时间，避免了长期加热对还原糖生物活性的影响。本研究结果表明，女贞子中有较高含量的还原糖，女贞子可以作为分离提纯功能性糖的最佳原料。

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Study on Extraction Technology of Reducing Sugar from Ligustrum lucidum Ait

XI Yan-li，ZHANG Yang-ting，DU Juan，OUYANG Shao-feng，FAN Xue-ni，WEI Zhen-qi
（School of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China）

The objects were to study the influence factors and extraction process which will influence the extraction process of reducing sugar from the Ligustrum lucidum Ait.With methanol as extraction solvent，the effects of extraction temperature，solid-liquid ration and reflux times on the extraction contents were considered. Then the contents of reducing sugar were measured by DNS colorimetry.The optimal extraction process was optimized with orthogonal experiments followed by single factor tests.The highest content of reducing sugar was obtained when the extraction temperature was 90℃，the solid-liquid ration was 1∶60（g/mL），and the reflux times were eight.At the optimum conditions determined by experiments，the extraction content of reducing sugar from Ligustrum lucidum Ait met 262.30 μg/mL，and the extraction coeffient was over 5.246%。

Ligustrum lucidum Ait；reducingsugar；orthofonaltest；DNSdetectionmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.008

2016-07-01

吉林省教育厅项目（2015403）；吉林市科技厅项目（201536113）；大学生创新创业训练项目（2015）

郗艳丽（1981—），女（汉），讲师，博士，从事食品毒理学研究。