和田黑鸡淋巴细胞的分离和总RNA提取

李 玮　艾东旭　李莲瑞

(1 塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔市 843300)(2 塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔市 843300)(3 新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔市 843300)



和田黑鸡淋巴细胞的分离和总RNA提取

李 玮1艾东旭1李莲瑞2,3*

(1 塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔市 843300)(2 塔里木大学动物科学学院， 新疆 阿拉尔市 843300)(3 新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔市 843300)

探讨和田黑鸡淋巴细胞最佳分离条件和淋巴细胞总RNA提取方法，为和田黑鸡淋巴细胞的免疫学研究提供最为有效的实验材料。采用离心法分离鸡外周血淋巴细胞并检测淋巴细胞活力。利用Trizol法提取和田黑鸡的外周血淋巴细胞总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳对所提取的RNA进行检测，并用核酸测定仪测定总RNA。结果表明：使用1:1比例的无Ca2+、Mg2+-Hank’S稀释液稀释抗凝血后，在室温、2 000 rpm/min、35 min的条件下离心分离所得的淋巴细胞效果最好。琼脂糖凝胶电泳结果显示出28S、18S和5.8S三条带，使用核酸测定仪测定的总RNA的OD260/280值为1.996，浓度为283 μg/ml，表明提取了高质量的总RNA，为开展后续的研究奠定了坚实的基础。

和田黑鸡； 淋巴细胞； 总RNA

和田黑鸡，又称“尼雅黑鸡”或“洛浦黑鸡”，是和田一种古老、独特的优良肉蛋兼用型地方品种，具有抗逆抗病性强、耐粗饲、抗高温等特点[1]。地方居民现今依然采用传统粗放散养的方式，使其保持了良好的生产性能，和沙漠腹地典型的绿色生态本质。和田黑鸡于2010年被列为国家级保护名录，截至2010年底，洛浦县共有和田黑鸡8. 6万羽[2]，主要分布在杭桂乡、洛浦镇、阿其克乡、恰尔巴格乡等地，均为农牧民散养，品种和数量在不断降低，如何提高黑鸡的饲养管理水平及开发利用，提高其经济利用价值，使和田黑鸡这一珍贵的家禽在数量、质量上得到提高，是摆在我们面前的重要任务[3]。我国和田黑鸡现处于保种维持状态，根据目前我国的状况，和田黑鸡的存在和发展成为至关重要的问题。国内的相关研究较少，仅对和田黑鸡的血液生理生化指标进行了测定；国外的研究主要针对地方品种参与免疫应答的组织和器官[4,5]。目前和田黑鸡具有较好的发展前景及研究价值。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器

和田黑鸡全血，无钙、镁Hank’s液、5%枸橼酸钠溶液、2%台盼蓝染液、鸡淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；其他试剂均为国产分析纯；电子天平(BS124S)；超净工作台(SW-CJ-2F型)；涡漩混合器(TDL-60B)；低速台式离心机(TDL-5)；高速台式冷冻离心机(Neofuge15R型)；全自动摄影生物显微镜(DP70+B10-olysLIA)；-70 ℃超低温冰柜(DN-HW328E)；电泳槽(DYCZ-28A)；电脑三恒多用电泳仪(DYY-60C型)；凝胶成像分析系统(Tanon-4100)；核酸蛋白测定仪(Bio Drop)。

1.2采血

8月龄的和田黑鸡活体，心脏采血法抽取10 mL和田黑鸡心脏血液，添加2 mL 4%枸橼酸钠溶液抗凝剂。

1.3淋巴细胞的分离

取10 mL新鲜抗凝血与无Ca2+、Mg2+Hank’s液按1:1稀释，缓慢上下倾斜混匀(避免剧烈振荡，细胞破裂)；干净试管中加入2 ml鸡淋巴细胞分离液，用移液枪吸取2 ml稀释抗凝血，沿试管壁缓慢注入其中，注意不破坏分离界面即可；2 000 rpm/min离心35 min后；小心吸取淋巴细胞层加入5倍体积无Ca2+、Mg2+Hank’s液，洗涤2～3次，每次4 ℃，1 500 rpm/min，离心20 min，最终得到较纯的淋巴细胞。

1.4淋巴细胞活力检测

取50 μL淋巴细胞悬液滴加在细胞计数板上，加入50 μL新鲜台盼蓝染液，充分混匀，5～10 min内于显微镜下观察。细胞活力检测：活细胞不着色，死细胞被染成蓝色。

1.5总RNA提取

取600 μL淋巴细胞，加入1 mL Trizol上下颠倒十次混匀后，室温静置30 min；加入200 μL氯仿，涡旋15 s，静置2 min，12 000 rpm离心15 min；取上清置于新的离心管中，随后加入500 μL异丙醇，室温孵化10 min，12 000 rpm离心10 min，用枪小心弃去上清液，加入75%乙醇1 mL，涡旋混匀，4 ℃，7 500 rpm离心5 min，再次弃去上清，吸干其沉淀表面液体，超净台中室温干燥5～10 min；最后加入30～60 μL的DEPC水溶解RNA，55 ℃～60 ℃水浴10 min，于-70 ℃保存备用。

1.6RNA鉴定

1.6.1完整性鉴定：取RNA样品10 μL，采用1%普通琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统拍照，记录鉴定结果。

1.6.2纯度鉴定：取2 μL的RNA样品，加入48 μL的DEPC水，充分混匀后注入微量比色杯中，用核酸分析仪测定RNA 的浓度和纯度。

2　结果与分析

2.1淋巴细胞分离结果

无Ca2+、Mg2+Hank’S稀释液、抗凝血和淋巴细胞分离液用1：1：1比例添加，离心后分层，层面分界更清晰(图1)。自上而下：第一层为血浆层；第二层很薄且呈白雾状为淋巴细胞层；第三层无色透明为离液层；第四层为深红色红细胞层，呈薄雾状的粒细胞附于红细胞表面。

图1　和田黑鸡外周血淋巴细胞分离结果

2.2淋巴细胞活力检测结果

取分离好的淋巴细胞悬液滴加在细胞计数板上，加50 ml新鲜台盼蓝染液，充分混匀，5～10 min内在显微镜下观察结果(见图2)。分别对活细胞和死细胞计数，按公式活细胞百分率=活细胞数/总细胞数×100%，得到淋巴细胞的存活率为93. 1%。

图2　和田黑鸡淋巴细胞台盼蓝染色结果(10×100)

2.3淋巴细胞RNA提取结果

RNA完整性鉴定：1%普通琼脂糖凝胶电泳分离的总RNA，凝胶成像系统拍照可见28S、18S及5.8S 3条清晰条带(见图3)。

图3　淋巴细胞RNA提取结果

RNA纯度鉴定：使用核酸蛋白测定仪对提取的总RNA的纯度进行检测，结果为OD260/230值为2. 134，OD260/280为1. 945。

3　讨论

3.1本实验采用简便易操作的Ficoll-U rografin(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心法分离和田黑鸡外周血淋巴细胞，关键步骤是分层离心时采用20～25 ℃，2 000 rpm/min，35 min，可见离心管内分为四层，分离得到淋巴细胞活性和纯度高，与谢昆、蒋成砚等[6]鸡淋巴细胞分离的结果基本一致。3.2实验过程中发现影响着淋巴细胞分离效果有很多因素。首先需要收集足量的新鲜和田黑鸡外周血液，此外，分离时采用的分离液的浓度、离心力、离心时间、温度以及实验中的操作[7]手法都会影响分离结果。

操作中收集存放血样时选择带有盖子的试管，上下倾斜4～5次，轻缓的使血液与抗凝剂充分结合，避免抗凝不完全或溶血现象；其次加液时，需做到贴壁轻缓的注入，稳定快速的完成，以避免时间过长导致细胞大量死亡；将得到的淋巴细胞洗涤2～3次后纯度较高。

3.3本实验采用Trizol法提取RNA。经过多组试验，提取的RNA纯度有时并不高，有时仅出现抹带，有时会出现基因组。由此得出，加入Trizol的量与裂解淋巴细胞的时间要充分。

使用电泳判断RNA的完整性。理论上，完整RNA的28S:18S的比例在2. 6:1左右 (即分子量之比)，然而由于较大分子量的RNA更容易降解，当28S有相当程度的降解时，18S(包括mRNA)却相当完整，故大部分资料中强调28S:18S的比例为2:1时，总RNA的质量较高[8]。本实验中电泳结果显示RNA几乎达到2:1的比例，说明从和田黑鸡淋巴细胞中提取的总RNA完整性较高。。

使用核酸测定仪测定总RNA的纯度，结果显示OD260/280在1. 7～2. 0之间时表明RNA 纯度高，如果小于1. 7，则说明有蛋白质的污染或是RNA 发生降解；同时测定OD260/230的比值，结果大于2. 0时RNA纯度高，反之如果远小于2. 0，则说明RNA样品中有大量的小分子或盐的存在[9]。本实验以和田黑鸡外周血淋巴细胞为原料，利用Trizol Reagent提取总RNA，提取方法不成熟时，提取的总RNA质量低，逐渐完善Trizol Reagent提取RNA的技术，最后提取的总RNA呈现28S rRNA，18S rRNA和5.8S rRNA三条清晰完整的条带，用核酸蛋白测定仪检测所提RNA的纯度，其OD260/280值为1. 945，OD260/230值为2. 134，说明提取的总RNA具有很高的纯度，为后续相关免疫应答基因的研究奠定基础。

[1]李小兵,刘黎,陆荷花. 和田黑鸡种质资源保护与利用探讨[J]. 禽业技术, 2010, 07(13): 120-125.

[2]焦珍珍,吴君来. 和田黑鸡种质资源保护现状与对策[J]. 中国畜禽种业, 2011, 09(4): 119-121.

[3]陆荷花,李小兵,张万和.新疆和田黑鸡的饲养管理与开发利用.[J]. 当代畜牧, 2010, 04(6): 4-6.

[4]Khobondo. J . O, Okeno . T . O, et al.Wasike and A .K . kahi . The fast, present and fufure genetic improv ment of indigen ous chicken of kenga [J]. Animal Gentic Resour ces , 2014,55:125-135.

[5]You Lu, Liu Ci, Yang Zijiang, et al. Prediction of Selenoprotein T Structure and Its Response to Selenium Deficiency in Chicken Immune Organs[J]. Biological Trace Element Research, 2014, 160(2):222-231.

[6]谢昆,蒋成砚,全舒舟,等. 鸡外周血淋巴细胞的分离和体外培养[J]. 中国家禽, 2011, 33 (11): 57-58.

[7]贺艳艳,潘辉,刘书东,等. 新疆多浪羊淋巴细胞分离和培养[J]. 塔里木大学学报, 2010, 22(04): 11-14.

[8]朱德华,等. 快速纯化真核细胞总RNA方法的改良[J]. 河南医学研究, 2001, 15(3): 115-117

[9]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京:高等教育出版社. 1993,59.

Isolation and Total RNA Extraction of Lymphocyte from Hetian Black Chicken

Li Wei1Ai Dongxu1Li Lianrui2,3*

(1 College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(2 College of Animal Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(3 Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production &Construction Group, Alar, Xinjiang 843300)

The experiment investigated the optimum separation conditions and the total RNA extraction method of lymphocyte, which provide the most effective experimental materials for the immunological study of lymphocytes in Hetian black chicken. Lymphocyte was separated by centrifugation and detected the cell activity. The total RNA was extracted from the peripheral blood lymphocytes by Trizol method. The results showed that the best effect of centrifugal separation was 1:1 ratio of Ca2+, Mg2+-Hank’S dilution of anticoagulant, room temperature, 2000 rpm/min, 35 min. Agarose gel electrophoresis showed three band of 28S, 18S and 5.8S,the OD260 / 280value of Total RNA was 1.996 and the concentration was 283 μg/ml, which indicating that high quality total RNA was extracted, laying a solid foundation for the follow-up studies.

Hetian black chicken; lymphocyte; total RNA

2015-06-10

李玮(1989-),女,在读硕士,研究方向为动物基因工程。E-mail：1225064596@qq.com

*为通讯作者E-mail：lilianrui51@163.com

1009-0568(2016)01-0001-04

S826

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.01.001