咳喘穴位敷贴对哮喘大鼠Th1/Th2免疫平衡的影响

肖小芹，贺艳萍，邓桂明*，陈　镇，李晓屏，欧阳林旗，肖望重，何海，舒圆月，向彪

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

·方药研究·

咳喘穴位敷贴对哮喘大鼠Th1/Th2免疫平衡的影响

肖小芹1，贺艳萍1，邓桂明2*，陈镇2，李晓屏2，欧阳林旗2，肖望重2，何海2，舒圆月1，向彪2

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

目的探讨咳喘穴位敷贴对哮喘大鼠辅助性T淋巴细胞1（Th1）/辅助性T淋巴细胞2（Th2）免疫平衡的影响。方法60只雄性SD大鼠随机分为6组：正常对照组、哮喘模型组、生芥子组、生炒各半组、炒芥子组、地塞米松组，每组10只。采用卵清蛋白致敏并激发的方法制备大鼠慢性哮喘模型，白芥子不同配比咳喘穴位敷贴散贴敷穴位干预治疗。采用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）测定各组大鼠血清中干扰素（IFN）-γ、白介素（IL）-4、白介素（IL）-13的含量。结果与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠血清IFN-γ含量明显降低，而IL-4、IL-13的含量明显升高（P＜0.01）。与哮喘模型组比较，生芥子组、生炒各半组、炒芥子组和地塞米松组的大鼠血清IFN-γ含量明显升高，而IL-4、IL-13的含量明显降低（P＜0.01），各治疗组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论咳喘穴位敷贴能够调节哮喘大鼠Th1/Th2免疫平衡，改善炎症反应，从而改善哮喘病情。

哮喘；穴位敷贴；白芥子；Th1；Th2

〔Abstract〕Objective To discuss the effects of kechuan acupoint application on Th1/Th2 cells immune balance of asthma rats.M ethods 60 male SD rats were random ly divided into control normal group，asthma model group，raw mustard group，half raw and half roasted mustard group，roasted mustard group，dexamethasone group，and with 10 rats in each group.The chronic asthma rat models were established by using ovalbumin to sensitize and stimulate，different proportion of white mustard acupoint application powder was as the intervention treatment.The levels of IFN-γ，IL-4 and IL-13 in serum of rats were detected by using ELISA.Results Compard with control group，the level of IFN-γin serum of rats in model group was decreased significantiy，while the level of IL-4，IL-13 in serum of rats in model group was increased significantiy（P＜0.01）.Compard with asthma model group，the IFN-γlevels in raw mustard group，half raw and half roasted mustard group，roasted mustard group，dexamethasone group were increased obviously，while the IL-4，IL-13 levels of rats in these groups were decreased（P＜0.01）.The results had no significant difference between the treatment group（P＞0.05）. Conclusion Kechuan acupoint application may adjust Th1/Th2 cells immune balance of asthma rats，to imporve the inflammatory response，and improve asthma condition.

〔Keywords〕asthma；acupoint application；white mustard；Th1；Th2

支气管哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病［1］。哮喘是世界上最常见的慢性疾病之一，目前全球哮喘患者已经达到3亿，各国哮喘患病率从1%～30%不等，我国约为0.5%～5%，尤其是儿童和青少年患病率高［2］，是严重危害人类健康和生活质量的常见病和多发病。

目前对哮喘的西医治疗主要依赖于支气管舒张剂和糖皮质激素吸入，但是长期、大剂量服用易使机体产生耐受和诸多不良反应。中药穴位贴敷疗法历史悠久，是我国传统医药的一大特色，目前已经广泛运用于临床内、外、妇、儿、五官、皮肤等各科各种疾病的防治，尤其是对肺系疾病如支气管哮喘、慢性支气管炎防治效果显著［3-6］。

大量研究已经证实哮喘的发病与辅助性T淋巴细胞1（Th1）/辅助性T淋巴细胞2（Th2）免疫失衡关系密切，即Th1型免疫反应减弱而Th2型免疫反应却异常增强，哮喘发病过程中Th1型细胞因子IL-12、IFN-γ等分泌减少，而Th2细胞分泌的IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等细胞因子增多［7-9］。因而调节Th1/Th2免疫平衡是研究治疗支气管哮喘的热点，IFN-Y及IL-4、IL-13等细胞因子可作为治疗支气管哮喘，抑制其炎性反应的效应指标。本研究从调节支气管哮喘免疫平衡出发，探讨咳喘穴位敷贴对哮喘的Th1/Th2免疫调节作用，为临床治疗提供部分理论依据。

1　材料

1.1实验动物

SPF级SD雄性大鼠60只，体质量150～170 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。许可证号：SCXK（湘）2015-0003。饲养条件：适应的光照，室温20～25℃，相对湿度40%-70%，标准饲料和饮用水。

1.2实验药物

咳喘穴位敷贴散［麻黄，批号：150501；紫菀，批号150401；肉桂，批号：15050；丁香，批号：15050；生芥子，批号：15050；炒芥子，批号：15050；延胡索（醋煮），批号：15050，均购自湖南新汇制药股份有限公司，甘遂（生，醋炙后使用），批号：2015062991，购自湖南三湘中药饮片有限公司］。地塞米松磷酸钠注射液（1 mL∶5 mg，国药集团容生制药有限公司，国药准字H41020036）

1.3实验试剂

鸡卵清蛋白，批号：A-5253，Sigma（分装）；大鼠IFN-γ定量检测试剂盒（ELISA），批号：CKE00219R；大鼠IL-4定量检测试剂盒（ELISA），批号：CK-E30647R；大鼠IL-13定量检测试剂盒（ELISA）批号：CK-E30652R，均为RD分装。

1.4实验仪器

402AI型超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；自制非完全封闭透明玻璃雾化箱（45 cm×25 cm×25 cm）；RM2235型石蜡切片机，德国Leica公司；XS-200型光学显微镜，江南光学仪器厂。

2　方法

2.1咳喘穴位敷贴散的制备

将咳喘穴位敷贴散中7味药材干燥，保持其他药物配比不变，采用芥子不同炮制品（生芥子、炒芥子、生炒各半）入药，分为咳喘穴位敷贴散生芥子组，咳喘穴位敷贴散生炒各半组，咳喘穴位敷贴散炒芥子组3个不同组方，生芥子组按原方甘遂、丁香、肉桂、生芥子、麻黄等比例为1.5∶3∶5∶9∶9…，生炒各半组甘遂、丁香、肉桂、生芥子、炒芥子、麻黄等比例为1.5∶3∶5∶4.5∶4.5∶9…，炒芥子组甘遂、丁香、肉桂、炒芥子、麻黄等比例为1.5∶3∶5∶9∶9…，将药物分别按比例混合后打粉，过6号筛，密封袋密封备用。

于市场上选购老姜，熬成姜汁，浓缩至1 g/mL药液，冷藏备用。使用时取咳喘穴位敷贴散粉末加姜汁调成糊状，制成1 cm×1 cm，厚度0.3 mm大小的药饼，用敷贴胶布固定于穴位上。

2.2哮喘模型建立及分组

大鼠适应性饲养1周后，60只大鼠随机取10只为正常对照组，其余为实验组按文献［7］方法并加以改进进行造模，实验第1、8天腹腔注射10%卵清蛋白生理盐水溶液（含卵清蛋白100 mg、Al（OH）3100 mg）1 mL/只致敏，第15天起开始用2%卵清蛋白生理盐水溶液雾化激发、诱喘，每次20 min，以大鼠出现烦躁、咳嗽、呼吸急促、点头运动、站立不稳继而疲倦、伏卧不动提示造模成功，隔天1次，至第56天雾化结束，共21次，正常对照组用生理盐水代替，致敏及诱喘方法同上。最后一次雾化结束后给实验组大鼠称质量并标号，随机分为哮喘模型组、生芥子组、生炒各半组、炒芥子组、地塞米松组，每组10只。

2.3药物干预

雾化结束第2天起给予生芥子组、生炒各半组、炒芥子组相应咳喘穴位敷贴散治疗，治疗选穴为大椎、肺俞（双）、脾俞（双）、肾俞（双），腧穴定位参考李忠仁主编的《实验针灸学》［10］。医用胶布固定，每次4 h，每天治疗1次，共治疗14 d。地塞米松组给予每只大鼠地塞米松磷酸钠注射液0.5 mg/kg注射，正常对照组及模型组不给予任何治疗。

穴位敷贴给药方法：在第一次给药前将穴位敷贴散给药组大鼠颈背部相应穴位处用8%Na2S溶液脱毛，脱毛程度：大鼠皮肤如裸鼠，对皮肤无刺激反应。因贴敷后大鼠活动而容易导致药贴脱落，因此加用透明胶布将药贴固定。

2.4动物处理与取材

第70天，在末次给药24 h内，给大鼠称质量，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，室温放置2 h后，3 000 r/min离心15 min，取上清液，放冰箱-20℃保存待测。采血后迅速打开胸腔取出左肺组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于HE染色，病理切片观察。

2.5指标观察及检测

2.5.1大鼠行为学观察大鼠造模过程中行为学变化。

2.5.2大鼠支气管及肺组织病理观察肺组织石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察大鼠支气管及肺组织病理形态学变化。

2.5.3大鼠血清INF-γ、IL-4、IL-13含量测定ELISA试剂盒检测法检测大鼠血清INF-γ、IL-4、IL-13含量，严格按照试剂盒说明书操作。

2.6统计学分析

采用SPSS 17.0进行数据处理和统计学分析，数据以“±s”表示，当方差齐性时组间比较采用单因素方差分析；当方差不齐时用非参数检验（Kruskal-Wallis H检验），以P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1大鼠行为学变化

正常对照组：大鼠精神状况良好，毛发有光泽，呼吸平稳，大小便正常，无喘息，咳嗽，呼吸困难等哮喘发作表现。其余大鼠在造模过程中：逐渐出现喘息、咳嗽、烦躁不安、点头运动、前肢缩抬、呼吸困难、腹式呼吸加重、腹肌痉挛、大小便失禁等哮喘发作表现，随着OVA激发次数增多，大鼠体质量下降，毛发暗淡无光泽，激发后期大鼠越发疲倦，活动减少，继而伏卧不动。

3.2各组大鼠支气管肺组织病理变化

正常对照组：大鼠肺组织及支气管内及周围无明显炎症细胞浸润，支气管内可见少量分泌物，管壁正常，肺泡形态规则。哮喘模型组：肺组织周围可见大量炎症细胞浸润，气道内有大量分泌物，肺泡间隔增厚，肺泡腔缩小，甚至可见纤毛上皮细胞脱落及杯状细胞增生现象。生芥子组、生炒各半组和炒芥子组：与哮喘模型组比较，支气管及肺组织炎症细胞浸润及管腔分泌物减少，肺泡壁排列相对规则。地塞米松组：支气管及肺组织可见炎症细胞浸润，管腔内有少量分泌物，肺泡排列规则。见图1。

图1　各组大鼠支气管及肺组织病理观察（HE×100）

3.3各组大鼠血清INF-γ、IL-4、IL-13含量变化

与正常组比较，模型组大鼠血清IFN-γ含量明显降低，而IL-4、IL-13的含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，生芥子组、生炒各半组、炒芥子组和地塞米松组的大鼠血清IFN-γ含量升高，而IL-4、IL-13的含量降低（P＜0.01），各治疗组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

4　讨论

气道免疫-炎症机制，是哮喘最主要的西医发病机制，气道慢性炎症是支气管哮喘的主要特征，它是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子共同参与、相互作用的结果。当外源性变应原通过吸入、食入或接触等途径进入机体后被抗原递呈细胞内吞并激活T细胞。一方面，活化的辅助性Th2细胞产生白介素（IL）如IL-4、IL-5和IL-13等激活B淋巴细胞，使之合成特异性IgE，后者与IgE受体相结合。当变应原再次进入体内，可与结合在细胞表面的IgE交联，使该细胞合成并释放多种活性介质导致气道平滑肌收缩，黏液分泌增加和炎症细胞浸润，这是一个典型的变态反应的过程。另一方面，活化的辅助性Th2细胞分泌的IL等细胞因子可直接激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞及肺泡巨噬细胞等，使之聚集在气道。这些细胞进一步分泌多种炎症介质和细胞因子，构成了一个与炎症细胞相互作用的复杂网络，导致气道慢性炎症［1］。

表1　各组大鼠血清INF-γ、IL-4、IL-13含量比较（±s，pg/mL，n=10）

表1　各组大鼠血清INF-γ、IL-4、IL-13含量比较（±s，pg/mL，n=10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

组别正常对照组哮喘模型组生芥子组生炒各半组炒芥子组地塞米松组INF-γ 1 330.9±245.2 513.2±97.9** 818.9±160.8△△816.9±166.4△△780.3±97.2△△843.1±204.1△△IL-4 43.05±7.97 115.36±10.95** 90.40±10.46△△90.13±16.83△△94.73±7.48△△89.74±16.03△△IL-13 15.50±2.90 32.20±3.75** 23.75±3.98△△24.28±4.29△△25.24±2.74△△23.61±5.71△△FP 21.921 38.121 17.778 0.000 0.000 0.000

本研究采用卵清蛋白致敏并激发的方法制备大鼠慢性哮喘模型，根据造模过程中大鼠的行为学改变和大鼠肺组织病理改变证明造模成功；在经穴位敷贴干预后结果表明穴位敷贴能够改善支气管与肺组织慢性炎症；ELISA结果表明穴位敷贴能够通过升高Th1型细胞因子IFN-γ，降低Th2型细胞因子IL-4、IL-13的含量，调节Th1/Th2免疫平衡，从而改善大鼠哮喘的炎症反应，达到治疗哮喘的作用。

本研究采用的咳喘穴位敷贴散为湖南中医药大学第一附属医院临床应用二十余年的医院制剂，主要由白芥子、麻黄、丁香、肉桂、甘遂、延胡索等药组成，全方具有祛风散寒，宣肺平喘，化痰止咳之功。清·张璐《张氏医通·诸门气下·喘》中记载：“冷哮灸肺俞、膏肓、天突，有应有不应。夏月三伏中，用白芥子涂法往往获效。方用白芥子净末一两、延胡索一两，甘遂、细辛各半两，共为细末。入麝香半钱，杵匀，姜汁调涂肺俞、膏肓、百劳等穴。涂后麻瞀疼痛，切勿便去。候三炷香足，方可去之。十日后涂一次，如此三次病根去矣。”咳喘穴位敷贴散即由此方根据临床经验加减，按一定比例制成，长期用于预防及治疗成人及儿童咳喘及慢性支气管炎等慢性呼吸系统疾病，疗效可靠、安全性高，深受广大患者欢迎。课题组前期曾对咳喘穴位敷贴散进行了质量控制研究及剂型改进，采用超临界CO2萃取技术提取了咳喘穴位贴散配方药物的有效部位［11］。在处方确定的基础上优选了基质的配比组成；筛选了1%氮酮为贴片透皮促进剂，对贴片的成型性进行了研究，采用热熔法制备了新型咳喘穴位贴片［12］；并进行了贴片体外透皮吸收和释放性研究以及二种剂型的体外透皮特性比较研究［13］，这些工作都表明利用现代科学和实验技术可以进一步促进穴位敷贴药物的渗透吸收，更好地发挥其药理作用，为穴位敷贴进一步的研究与开发利用提供了扎实的基础。

白芥子为穴位敷贴疗法最基本的药物，其性味辛、温，具有温肺豁痰利气，散结通络止痛之功。实验研究证实生芥子药粉有一定的促渗透作用，而炒芥子则无，生芥子外用有使皮肤发红发泡的功效，可加强其他药物的透皮吸收作用［14］。敷贴中生芥子一般作为发泡药物使用，偏于散结通络止痛，而炒芥子功效偏于温肺豁痰利气，多用内服。由于临床上咳喘穴位敷贴散发泡药物运用不规范，有的使用炒芥子，有的使用生芥子，使得患者皮肤敷贴处无反应或者皮肤出现红斑、疼痛、发痒难忍甚至发泡，如烧烫伤，皮肤反应效果不一，导致临床治疗效果也不一样。临床研究表明调整白芥子在药物中的配比，能够既保证临床疗效，同时又减少患者的皮肤反应，保证用药的安全性［15-17］。生芥子与白芥子功效侧重点不同，本研究在从咳喘穴位敷贴散对哮喘大鼠Th1/Th2免疫平衡影响探讨其对哮喘的疗效，保持敷贴中其他药物不变，采用芥子不同炮制品入药调整生芥子白芥子的配比来进行哮喘大鼠穴位敷贴实验，探讨治疗效果是否有差异，为临床治疗提供实验依据。但在三组白芥子不同配比咳喘穴位敷贴散治疗过程中大鼠皮肤并无红斑、水肿等反应，可能与人与大鼠用量差异有关，大鼠与人体体表面积的差异，导致大鼠穴位与人体穴位定位有所不同，而所用穴位敷贴散剂量偏小，并不会像临床上一样引起皮肤反应，而治疗效果差异也无统计学意义。所以穴位敷贴能够通过调节Th1/Th2免疫平衡，从而改善大鼠哮喘的炎症反应，达到治疗哮喘的作用。关于咳喘穴位敷贴散白芥子配比及疗效差异，以及穴位敷贴治

［1］葛均波，徐永健.内科学［M］.第8版.北京：人民卫生出版社，2013：28.

［2］Pocket Guide for Asthma Management and Prevention.Global Initiative for Asthma（GINA）［J］.2011.Availahle from http：// www.ginasthma.

［3］刘妮娜，宋翠琴，徐海霞.冬病夏治穴位贴敷配合护理干预治疗小儿哮喘临床观察［J］.中医药临床，2013，25（1）：24-25.

［4］陈玉，胡晓灵.中药穴位敷贴治疗支气管哮喘作用机制研究进展［J］.新疆中医药，2011，29（5）：80-81.

［5］高维银，任辉杰.冬病夏治穴位敷贴疗法治疗小儿哮喘缓解期100例临床观察［J］.湖南中医药大学学报，2012，32（9）：77-78.

［6］陈晓勤，许勇，倪伟.“阳虚哮喘敷贴方”穴位敷贴对支气管哮喘免疫机制的影响［J］.中国中医急症，2012，21（5）：701-702.

［7］李辉，吴振宇，张云，等.消喘膏穴位贴敷对卵蛋白诱发哮喘大鼠Thl/TIl2的调节作用［J］.北京中医药大学学报，2012，35（9）：623-625.

［8］耿立梅，闫红倩，赵烁，等.中医药外治法调节哮喘Th1/Th2免疫平衡的研究进展［J］.临床荟萃，2013，28（6）：696-698.

［9］陈玉.三九贴穴位贴敷对哮喘大鼠血清IgE和IL-10含量影响的研究［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学，2011.

［10］李忠仁.实验针灸学［M］.北京：中国中医药出版社，2007：325-326.

［11］邓桂明，陈镇，杨广民，等.超临界二氧化碳萃取咳喘穴位贴片药材的工艺研究［J］.中国医院药学杂志，2007，27（11）：1 493-1 497.

［12］邓桂明，杨广民，陈镇，等.咳喘穴位贴片基质配比的实验研究［J］.中国现代药物应用，2008，2（1）：1-2.

［13］邓桂明，陈镇，杨广民，等.咳喘穴位贴片的体外透皮实验研究［J］.中南药学，2008，6（2）：134-137.

［14］房恭，周雪忠，刘保延，等.冬病夏治穴位贴敷基本药物和穴位研究［J］.中医杂志，2009，50（9）：794-797.

［15］崔淑华，李娜，刑燕军，等.白芥子不同配比穴位贴敷防治支气管哮喘的皮肤反应及疗效分析［J］.辽宁中医杂志，2014，41（12）：2 636-2 638.

［16］崔淑华，李娜，刑燕军，等.白芥子不同配比穴位贴敷防治支气管哮喘患者免疫球蛋白及嗜酸性粒细胞的影响［J］.中医杂志，2014，55（11）：935-938.

［17］姚国红，徐列波.不同白芥子炒制程度对穴位贴敷后患者皮肤的影响［J］.上海针灸杂志，2015，34（1）：57.

（本文编辑 匡静之）

Effects of Kechuan Acupoint Application on Th1/Th2 Cells Immune Balance of Asthma Rats

XIAO Xiaoqin1，HE Yanping1，DENG Guiming2*，CHEN Zhen2，LI Xiaoping2，OUYANG Linqi2，XIAO Wangzhong2，HE Hai2，SHU Yuanyue1，XIANG Biao2
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

·名医撷华·

R285.5；R245.9

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.002

2015-11-30

湖南省中医药科研计划重点项目（201443）；湖南省教育厅重点项目（13A067）。

肖小芹，男，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：中西医结合基础研究。

*邓桂明，女，博士，副主任药师，硕士研究生导师，E-mail：705500732@qq.com。