柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠模型心肌细胞HERG K+通道蛋白的研究

刘建和，杨成龙，苏联军，周正，刘锦霞，唐银，胡志希，王建国

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南长沙410007；3.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠模型心肌细胞HERG K+通道蛋白的研究

刘建和1，2，杨成龙1，2，苏联军3，周正3，刘锦霞3，唐银3，胡志希2，王建国2

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南长沙410007；3.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

目的探讨柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠心肌中HERG K+通道蛋白表达的影响，为柴胡三参胶囊的临床应用提供实验依据，为缺血性心律失常的中医药治疗提供更多的治疗途径。方法将大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、柴胡三参胶囊（青蒿）组、柴胡三参胶囊（常山）组、稳心颗粒组、胺碘酮组，每组各10只，药物组在结扎左冠状动脉前降支前10 d开始预先给药，连续10 d，观察大鼠结扎左冠状动脉前降支后心电图改变及心肌中HERG K+通道蛋白表达。结果柴胡三参胶囊能够降低缺血性心律失常的发生率（P＜0.05）、显著性的降低大鼠心肌细胞HERG K+通道蛋白的失活（P＜0.01）。结论柴胡三参胶囊抗缺血性心律失常的效果明显，心肌细胞HERG K+通道蛋白是其作用靶点。

柴胡三参胶囊；缺血性心律失常；HERG K+

〔Abstract〕Objective To investigate Chaihu Sanshen capsule on myocardial ischemic arrhythmia mice HERG K+channel protein expression in ischemic arrhythmia rat models，and provide more experimental basis for clinical use of Chaihu Sanshen capsule.M ethods The rats were random ly divided into blank group，sham-operation group，model group，Chaihu Sanshen（Qinghao）group，Chaihu Sanshen（Changshan）group，Wenxin granule group，amiodarone group，10 rats in each group. The drug group was given pretreatment for 10 days before 10 days of left anterior descending coronary artery.The change of electrocardiogram and myocardial HERG K+channel protein expression in left anterior descending coronary artery was observed.Results Chaihu Sanshen capsule can reduce the incidence of ischemic arrhythmias（P＜0.05），and significantly reduce the HERG K+channel protein inactivation（P＜0.01）.Conclusion The antiarrhythmic effect of Chaihu Sanshen capsules is obvious，and its targets are HERG K+channel proteins.

〔Keywords〕Chaihu Sanshen capsule；ischemic arrhythmias；HERG K+

缺血性心律失常（Ischemic arrhythmias）是冠心病的常见并发症，是临床上缺血性心脏病常见的病理生理过程，发病率高，是发生心源性猝死的主要原因，严重威胁着人类健康。研究发现心脏HERG K+通道属于电压依赖性钾通道，其介导的快速激活延迟整流钾电流（IKr）是人类心肌细胞动作电位3期快速复极的主要电流，是心脏电活动的基础，心肌缺血主要影响HERG K+通道的失活过程，导致动作电位时程缩短，诱发缺血性心律失常，因此成为致死性心律失常的重要生物靶标［1］。本课题从HERG K+通道进行研究，进一步探讨柴胡三参胶囊作用机制，为缺血性心律失常的中医药治疗提供更多的治疗途径。

1　材料与方法

1.1实验动物

清洁级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体质量（200±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［许可证编号：SCXK（湘）2012-0001，动物合格证号（11400700061625，11400700070275）］。

1.2实验药物与试剂

柴胡三参胶囊（SHSS）（青蒿与常山均是传统的抗疟疾中药，都具有传统的抗心律失常作用［1-2］，根据普通高等教育“十一五”国家级规划教材中药学第二版，常山有毒，在原有配方不变的情况下，更改常山为青蒿，特在此实验中分为两组对比观察），湖南中医药大学第一附属医院制剂室生产提供柴胡三参胶囊（青蒿）（批号：140403）、柴胡三参胶囊（常山）（批号：140820）；HERG K+通道反应蛋白一抗，北京博奥森生物技术有限公司提供（生产日期：2014-04-18）；二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司提供（批号：K142714C）。

1.3实验仪器

WD407型小动物呼吸机，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；RM6280型多道生理信号采集处理系统以及图像识别分析系统，成都仪器厂；光学显微镜，上海泸星光学仪器有限公司。

1.4实验分组与给药

将大鼠随机分为7组：空白组、假手术组、模型组、柴胡三参（青蒿）组、柴胡三参（常山）组、胺碘酮组、稳心颗粒组，各组10只，各组在结扎左冠状动脉左前降支前10 d开始预先给药，连续10 d，分别予以生理盐水、相应药物灌胃。给药量按成人70 kg、大鼠200 g体表面积换算（公式为D2=D1×R2/R1），并按重量调整剂量。

1.5动物模型制备

根据朱丽红［3］、张页［4］及徐叔云的《药理实验方法学》［5］的造Wistar大鼠冠心病气虚痰瘀模型方法稍作改进。末次给药30 min后大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）进行麻醉，用生物信号采集器全程记录II导联心电图，气管切开、插管、接呼吸机。打开胸腔，分离心包膜，轻掀左心耳，从左心耳下缘处进针，在肺动脉旁出针，结扎左冠状动脉前降支，以II导联ST段明显抬高或T波高耸，肉眼观察结扎线以下心脏表面区域颜色变暗为结扎成功标志，结扎30 min后再灌注40 min。空白组腹腔只麻醉不开胸不结扎，假手术组只开胸不结扎。

1.6大鼠死亡率及心律失常评分

在实验过程期间，因意外原因死亡大鼠剔除最后数据统计，因恶性心律失常而死大鼠则进入心电图室性心律失常评分统计，但不进入其他指标检测项目之中。采用Curtis和Walker（1988）心律失常评分法对心律失常严重程度进行定量分析。

1.7HERG K+通道蛋白的表达检测

应用免疫组织化学检测法检测缺血区心肌组织中HERG K+通道蛋白的表达水平。

1.8统计学分析处理

所有数据均用SPSS 22.0统计软件分析，所有数据均采用“±s”表示。计量资料采用t检验，方差不齐者换用校正t检验；非正态分布采用Wilcoxon秩和检验；所有计数资料均采用χ2检验；所有等级资料均采用Wilcoxon秩和检验或Ridit分析。

2　结果

2.1各组大鼠死亡情况

在喂养及手术期间，因不明原因突然死亡，或麻醉意外，或多次结扎致大出血等死亡的剔除于心电图统计分析及最后数据统计，但因恶性心律失常而死亡的大鼠进入心电图统计分析，但不进入最后的数据统计。在实验过程中，因室颤死亡的模型组4只，死亡率44.4%；柴胡三参青蒿组2只，死亡率12.5%；柴胡三参常山组2只，死亡率22.2%；稳心颗粒组1只死亡率11.1%；胺碘酮组4只，死亡率40%。

2.2各组大鼠室性心律失常评分

实验缺血再灌注期间，除假手术组因机械性心肌损伤出现短暂室速外，模型组及SHSS组均有发生多种室性心律失常，与假手术组比较，模型组心室扑动（VP）、心室颤动（VF）发生次数增多（P＜0.01），心律失常评分升高。与模型组比较，SHSS组VP、VF发生次数及心律失常评分明显降低。见表1。

2.3HERG K+免疫组化染色结果

空白组：心肌细胞排列规则，核呈杆状，可见横纹，细胞间质分布均匀，毛细血管丰富，未见炎性细胞浸润；假手术组：心肌细胞排列欠规则，核呈杆状，细胞间质分布较为均匀，未见炎性细胞浸润；模型组：心肌细胞排列紊乱，大量细胞肥大水肿变性，横纹溶解消失，有大量炎性细胞浸润；柴胡三参胶囊（青蒿）组：心肌细胞排列较紊乱，部分细胞水肿变性，横纹溶解消失，间质少量炎性细胞浸润；柴胡三参胶囊（常山）组：心肌细胞排列紊乱，大量细胞水肿变性，横纹溶解消失，间质大量炎性细胞浸润；稳心颗粒组：心肌细胞排列较紊乱，部分细胞水肿变性，纤维断裂，间质增宽，较多炎性细胞浸润；胺碘酮组：心肌细胞排列紊乱，大量细胞肥大水肿变性，横纹溶解消失，有大量炎性细胞浸润。

表1　各组大鼠心律失常情况及评分（±s）

表1　各组大鼠心律失常情况及评分（±s）

注：与模型组比较：▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；与稳心颗粒组比较：★★P＜0.01，★P＜0.05。

组别模型组柴胡三参（青蒿）组柴胡三参（常山）组稳心颗粒组胺碘酮组n 10 8991 0 VP（次）29.20±5.25 4.00±1.69▲▲★3.11±2.03▲▲★2.56±2.13▲▲15.60±3.69▲★★★VF（次）14.5±03.03 2.63±1.60▲▲★2.00±1.66▲▲★1.22±0.97▲▲6.80±1.93▲▲★★VT（次）41214评分（分）5.40±0.52 1.13±0.03▲▲★1.67±0.50▲▲★1.00±0.93▲▲3.60±2.17▲★★

图1　大鼠缺血区组织形态学光镜图（HE染色，×400）

2.4各组间HERG K+通道的蛋白表达水平

将空白组、假手术组、模型组、各药物组HERG K+通道蛋白平均灰度相比较，结果符合方差齐性及正态分布，采用t检验。柴胡三参胶囊能够显著性的降低HERG K+通道蛋白的失活（P＜0.01），且柴三（青蒿组）与柴三（常山组）无差异性。见表2。

表2　HERG K+通道蛋白平均灰度组间比较

3　讨论

抗心律失常西药存在致心律失常及安全性等诸多问题，近年来多项临床研究证实，中药可通过多靶点、多途径、多离子通道阻滞和非离子通道调节的整合机制，发挥调节心律失常作用［6-8］。从此共识出发，中医中药在心律失常的防治上大有可挖掘之处。柴胡三参胶囊是在认为心悸的基本病机少阳不和，治法为“和解定悸”的指导思路下由小柴胡汤加减而来的。方中以柴胡为君，达肝入少阳，疏泄肝郁、升发肝气、和解少阳之邪；配伍黄芩，清泄少阳湿热之邪，柴胡配伍黄芩为经典和法配伍；臣以法半夏下气化痰，丹参活血清心，苦参通利清火，青蒿截邪并配合柴胡和解少阳之邪；党参、甘草缓急益气，调和诸药共为佐使。全方合用标本兼治，邪去而正安，又扶正兼祛邪，以达和解稳律之目的。柴胡三参胶囊前期临床及实验研究也已表明其抗心律失常疗效确切［9-12］。

HERG基因编码的K+通道称为HERG K+通道，HERG K+通道与室性心律失常密切相关，心脏HERG K+通道属于电压依赖性钾通道，其介导的快速激活延迟整流钾电流（IKr）是人类心肌细胞动作电位3期快速复极的主要电流，是心脏电活动的基础［13］。在本实验中，结合心电图统计分析，心律失常发生率低的柴胡三参胶囊组中HERG K+通道蛋白的表达较心律失常发生率高的模型组明显降低且存在显著性差异。从而证实HERG K+是柴胡三参胶囊抗心律失常的作用靶点之一。

同时，目前研究得比较清楚的是肾上腺素能对HERG K+通道的调控［14-15］，β1-AR通过Gs蛋白激活腺苷酸环化酶（AC），使细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，cAMP激活蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC），引起HERG K+通道蛋白直接发生磷酸化，刺激加速HERG K+电流外流，减弱HERG K+电流内流导致快速型室性心律失常。本实验的前期研究了柴胡三参胶囊对缺血性心律失常的大鼠模型缺血心肌中的PKA、PKC表达影响研究，结果亦证实在心律失常发生率低的柴胡三参胶囊组PKA、PKC的表达亦降低。

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（本文编辑李杰）

Effect of Chaihu Sanshen Capsule on M yocardial Cell HERG K+Channel Protein in Ischem ic Arrhythm ia Rat M odels

LIU Jianhe1，2，YANG Chenglong1，2，SU Lianjun3，ZHOU Zheng3，LIU Jinxia3，TANG Yin3，HU Zhixi2，WANG Jianguo2
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007 China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R256.21

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.005

2015-12-26

湖南省科技厅科研项目（2013SK3103）；湖南省中医药管理局重点课题（201303）；湖南省重点实验室开放基金计划项目（2014XNFZ03）；湖南省科技创新项目投资计划（［2014］658）；2015年湖南省学位与研究生教育教改研究课题（JG2015B071）。

刘建和，男，博士，主任医师，博士研究生导师，研究方向：心血管疾病的中医药防治。