马归液对腺性膀胱炎大鼠膀胱组织Bcl-2、Bax表达的影响

蔡蔚，谢海平，龙蠡，谢晓，杨华伟

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

马归液对腺性膀胱炎大鼠膀胱组织Bcl-2、Bax表达的影响

蔡蔚，谢海平，龙蠡，谢晓，杨华伟

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

目的通过观察马归液对腺性膀胱炎大鼠模型膀胱组织的影响，为运用马归液治疗腺性膀胱炎提供实验基础和理论依据。方法首先通过对大鼠膀胱灌注大肠埃希菌成功建立腺性膀胱炎大鼠模型，然后对造模成功的大鼠分别灌注马归液第1组为1次/周；马归液第2组为2次/周、吡柔比星、生理盐水8周，再对各组大鼠膀胱组织进行病理学检查、透射电镜检测和Bcl-2、Bax基因表达检测，以观察各组大鼠膀胱黏膜组织结构的变化。结果经马归液灌注，马归液1组、马归液2组病理学检查显示膀胱组织正常无炎性病变；Bax、Bcl-2灰度均值比较，马归液2组、马归液1组的灰度均值与生理盐水组比较，均有统计学意义（P＜0.05），马归液2组与马归液1组比较，无统计学意义（P＞0.05）；Bcl-2/ Bax中，马归液1组、马归液2组分别与吡柔比星组、生理盐水组组间比较中均有统计学意义（P＜0.05），马归液2组与马归液1组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论马归液对大鼠腺性膀胱炎膀胱黏膜有明显治疗效果，具有修复作用，且一周灌注两次疗效最佳。

腺性膀胱炎；大鼠；马归液；Bcl-2；Bax

〔Abstract〕Objective To observe the effect of Magui liquid on bladder tissues in rats with cystitis glandularis，and to provide the experimental basis and theoretical basis for the treatment of cystitis glandularis.Methods Firstly，the model rats with cystitis glandularis were successfully established by bladder instillation of Escherichia coli.The successful model rats were given Magui liquid（group 1：once a week；group 2：twice a week），pirarubicin and physiological saline for eight weeks.Then，the bladder tissues of rats in each group were given pathological examination and electron microscopy assay，and the Bcl-2，Bax expressions were detected.The changes of the structure of bladder mucosa in rats were detected.Results After the perfusion of Magui liquid，the pathological examination of Magui liquild groups showed that the bladder tissue had no inflammatory disease.Compared with the physiological saline group，the Bax and Bcl-2 gray mean were statistically significant（P＜0.05），the diffrences between Magui liquild groups were not statistically significant（P＞0.05）.Compared with pirarubicin and physiological saline group，the Bcl-2/Bax in Magui liquild groups was statistically significant（P＜0.05），the Bcl-2/Bax between Magui liquid groups has no statistically significant（P＞0.05）.Conclusion Magui liquild shows obvious effect and repair functioon on the glandular cystitis bladdermucosa of rats，and the rats with best curative effect are given perfusion for two times a week.

〔Keywords〕cystitis glandularis；rats；Magui liquild；Bcl-2；Bax

腺性膀胱炎是一种膀胱黏膜增生性病变，以尿频、尿急、耻骨上方胀痛及夜尿等为主要表现的慢性膀胱疾患，随着腔内泌尿外科技术的普及，膀胱镜检及病理活检技术的提高，腺性膀胱炎的检出率明显升高［1］，临床资料提示腺性膀胱炎与膀胱肿瘤有一定关系，多数学者认为［2］腺性膀胱炎是潜在的癌前病变。目前治疗上多采用经尿道膀胱电灼术及化疗药膀胱灌注等措施，但对机体组织存在明显的副作用。目前尚无有效措施从根本上解决腺性膀胱炎，因此对腺性膀胱炎及膀胱癌的防治研究显得尤为重要。本实验以腺性膀胱炎大鼠模型为研究对象观察自制马归液对其作用机制，现将实验报告如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物成年雌性SD大鼠62只，体质量（220±10）g，由湖南中医药大学第一附属医院实验室提供。自由饮水，普食喂养，适应饲养1周。

1.1.2药物吡柔比星药液制备：吡柔比星冻干粉针剂30 mg，加注射用水配成50 mL溶液备用（吡柔比星，10 mg/支，深圳万乐药业有限公司生产，批号为（1505c4）。马归液：由马鞭草30 g，当归20 g，赤芍20 g，生黄芪20 g四味药物制备而成，以上药材由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制剂中心提供，经湖南中医药大学中药学教研室鉴定符合药典规定。大肠埃希菌溶液（浓度在108～109CFU/100 uL）由湖南中医药大学第一附属医院检验科微生物室提供。25%乌拉坦溶液（由湖南中医药大学实验动物中心提供）。

1.1.3特殊药品制作大肠埃希菌溶液的制备：在无菌条件下，从-70℃冰箱取出DH5a大肠埃希菌菌种，挑起菌种接种在装有5 mL LB培养基的无菌离心试管中，置于37℃恒温摇床，转速150 r/min。10 h后，用分光光度仪测定大肠杆菌的浓度，保持浓度在108～109CFU/100μL浓度。马归液的制备：由马鞭草30 g，当归20 g，赤芍20 g，生黄芪20 g。制备工艺：将当归冷浸0.5 h，用水蒸气蒸馏提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣与马鞭草、赤芍、黄芪加水煎煮三次，加水量分别为药材量的10倍、8倍、8倍，第1次2 h，第2、3次各1.5 h，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，静置24 h，滤过，浓缩至近50 mL，加入防腐剂适量与当归挥发油，调整总量至50 mL，搅匀，灌封，灭菌，即得。

1.2方法

1.2.1实验动物模型的制备

1.2.1.1腺性膀胱炎大鼠造模过程将成年雌性SD大鼠62只，完全随机分为3组：空白组（10只）、生理盐水灌注组（10只）和造模组（42只）；造模组：膀胱灌注DH5α大肠杆菌溶液（108-109CFU/100UL）0.2 mL，隔日1次，共20次；生理盐水灌注组：膀胱灌注生理盐水，隔日1次，共20次。空白组不行膀胱灌注。用25%乌拉坦按1.0 g/kg剂量腹腔注射麻醉SD大鼠，仰卧固定大鼠，常规消毒会阴部。将无菌硬膜外导管用无菌液体石蜡润滑后，提起尿道外口的皮肤，沿尿道后壁插入尿道1 cm左右。通过抽吸导管排除大鼠残余尿液，分别用1 mL注射器向大鼠膀胱注入0.2 mL无菌生理盐水、大肠杆菌溶液。然后退出导管，将大鼠放入鼠笼等待自然苏醒。50天后每组随机选取大鼠2只，处死取出膀胱，行H-600型透射电子显微镜超微病理检测及病理学检测，造模组大鼠膀胱黏膜固有层出现炎性浸润、Brunn巢、囊腔，证实造模成功。

1.2.1.2给药将造模成功的大鼠40只，完全随机分成四组：生理盐水组、马归液1组、马归液2组、吡柔比星组。生理盐水组：每周一麻醉后膀胱灌注1次生理盐水，持续8周；马归液1组：每周一麻醉后膀胱灌注一次马归液，持续8周；马归液2组：麻醉后膀胱灌注2次马归液，时间分别为周一、周五，持续8周；吡柔比星组：每周一麻醉后膀胱灌注1次吡柔比星注射液，持续8周。

1.2.2标本切取60 d后对全部模型大鼠用25%乌拉坦溶液进行麻醉，剂量为1.0 g/kg；然后进行断颈处死，取仰卧位，固定四肢；剪开会阴部皮肤，提起大鼠膀胱底部，分离至尿道近端剪断，取出膀胱。

1.2.3各组标本常规病理学检查及免疫组化检测观察膀胱的大体形态，迅速用10%甲醛溶液将膀胱体部和膀胱三角固定。用10%甲醛溶液将标本定型、然后用流水冲洗，再用酒精进行脱水，使用二甲苯将标本进行两次透明，然后标本浸蜡，用硬蜡将浸蜡后的标本包埋，并做好标记。并对包埋好的标本修切，进而连续常规切片、展片、HE染色。做好切片，分别置于100倍、200倍、400倍显微镜下观察膀胱黏膜固有层是否有炎性细胞浸润、腺体样结构、囊腔和Brunn巢结构。免疫组化检测bcl-2及Bax，具体操作见说明书。

1.2.4各组大鼠透射电镜检查取材：将膀胱标本切成组织块约1 mm×1 mm×3 mm大小。固定：在由2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制的固定剂中进行不少于2 h的固定，再漂洗3次，漂洗剂为0.1M磷酸漂洗液，每次一刻钟左右；再次固定1-2 h，固定剂为1%锇酸固定液，漂洗3次，漂洗剂为0.1M磷酸漂洗液，每次一刻钟左右。脱水：50%丙酮10-15 min，70%丙酮10～15 min，90%丙酮10-15 min，100%丙酮15～20 min，中间更换一次。浸泡、包埋：使用纯丙酮+包埋液（1∶1），在37℃下进行12小时的浸泡、包埋；然后在纯包埋液、37℃下，进行10-12 h的浸泡、包埋。固化：37℃烘箱内过夜固化，然后60℃烘箱内固化12～24 h。超薄切片机切片50-100 nm。3%醋酸铀以及硝酸铅双染色。FEI Tecnai G2 Spirit透射电镜观察。

1.2.5Real-time PCR实验标本制取过程［3］引物设计从NCBI中下载以下基因序列，引物设计采用Primer 5.0软件，引物序列见表1。Real-time PCR法检测Bcl-2及Bax基因表达，操作过程见说明书。

表1　用于多重PCR扩增的特异性引物

2　结果

2.1病理结果

生理盐水组：可见膀胱黏膜上皮层变薄，基底层空泡样变，固有层排列混乱，血管增多，局部有炎性浸润，可见腺体样结构；马归液1组、马归液2组：上皮细胞排列正常，未见炎性浸润；吡柔比星组：可见膀胱黏膜上皮层变厚，基底层空泡样变，固有层排列混乱，血管增多，未见炎性浸润。见图1。

2.2体视学图像分析

Bax表达中，马归液2组的灰度值均数明显小于吡柔比星组，马归液2组灰度与吡柔比星组、生理盐水组比较均具有统计学意义（P＜0.05），与马归液1组比较无统计学意义（P＞0.05）；吡柔比星组的灰度均数明显大于生理盐水组、马归液1组，吡柔比星组的灰度与马归液1组、生理盐水组比较具有统计学意义（P＜0.05）；马归液1组与生理盐水组相比较具有统计学意义（P＜0.05）。Bcl-2表达中，灰度值均数由大到小分别为：马归液2组、马归液1组、生理盐水组、吡柔比星组；马归液2组的灰度与吡柔比星组、生理盐水组比较具有统计学意义（P＜0.05），与马归液1组比较无统计学意义（P＞0.05）；马归液1组的灰度与生理盐水组、吡柔比星组比较具有统计学意义（P＜0.05），吡柔比星组的灰度与生理盐水组比较具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1　膀胱组织HE染色图（×400）

表2　各实验组的Bax、Bcl-2灰度值（±s，n=10）

表2　各实验组的Bax、Bcl-2灰度值（±s，n=10）

注：Bax表达中，吡柔比星组、生理盐水组比较，*P＜0.05，与马归液1组、生理盐水组比较，★P＜0.05；与生理盐水组相比较，☆P＜0.05。Bcl-2表达中，与吡柔比星组、生理盐水组比较，□P＜0.05，与马归液1组比较，□P＞0.05；与生理盐水组、吡柔比星组比较，■P＜0.05，与生理盐水组比较，●P＜0.05。

组别生理盐水组吡柔比星组马归液1组马归液2组Bax 86.7±22.4 94.5±25.4★75.6±22.5*★☆69.7±9.1* Bcl-2 87.5±46.0 80.5±31.0●93.3±21.9■99.6±18.3□

2.3电镜结果

生理盐水组：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮可见聚集的炎性细胞，并存在炎性浸润，各细胞完整，细胞间连接稍疏松；细胞内线粒体存在大量空泡样变，提示线粒体大量钙化；核仁饱满；溶酶体增多，高尔基体可见；马归液1组：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮可见单个的炎性细胞，无炎性浸润，各细胞完整，细胞间连接紧密；细胞内线粒体存在少量空泡样变；核仁饱满；溶酶体减少，高尔基体可见；马归液2组：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮未见炎性细胞，各细胞完整，细胞间连接紧密；细胞内线粒体存在少量空泡样变，核仁饱满；溶酶体数量大致正常，高尔基体可见；吡柔比星组：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮未见炎性细胞，细胞活性降低，并出现细胞撕裂，细胞间连接疏松；细胞内线粒体存在大量空泡样变；大部分核仁饱满，少量核仁畸形；溶酶体减少，高尔基体可见。见图2。

图2　膀胱组织电镜观察图（×400）

2.4Real-time PCR实验结果

如表3所示：（1）Bcl-2/β-actin中，马归液2组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较中有统计学意义（P＜0.05）；马归液1组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较中有统计学意义（P＜0.05）；马归液1组与马归液2组比较无统计学意义（P＞0.05）；（2）Bax/ β-actin中，吡柔比星组与其余三组比较均有统计学意义（P＜0.05），马归液1组、马归液2组与生理盐水组组间比较均无统计学意义（P＞0.05）；（3）Bcl-2/Bax中，比值均数由大到小依次为：生理盐水组、马归液2组、马归液1组、吡柔比星组；马归液2组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较中有统计学意义（P＜0.05）；马归液1组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较中有统计学意义（P＜0.05）；马归液1组与马归液2组比较无统计学意义（P＞0.05）。

如图3所示，Bax电泳结果马归液2组、马归液1组条带光谱密度最低，生理盐水组条带光谱密度有所增强，吡柔比星组条带光谱密度最强；如图F所示，Bcl-2电泳结果马归液2组、马归液1组、生理盐水组条带光谱密度无明显差异，但均明显强于吡柔比星组条带光谱密度。

表3　Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin、Bcl-2/Bax各组间相对表达量（±s，n=10）

表3　Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin、Bcl-2/Bax各组间相对表达量（±s，n=10）

注：①Bcl-2/β-actin，马归液2组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较○P＜0.05；马归液1组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较♂P＜0.05；②Bax/β-actin，与吡柔比星组比较◆P＜0.05；③Bcl-2/Bax，马归液2组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较▼P＜0.05；马归液1组、吡柔比星组与生理盐水组组间比较▽P＜0.05。

分组生理盐水组吡柔比星组马归液1组马归液2组Bcl-2/β-actin 1.3875±0.1879○♂0.8213±0.1360○♂1.1863±0.1360 1.1438±0.1951○♂Bax/β-actin 0.8225±0.0465◆0.9825±0.1152 0.8500±0.0141◆0.8213±0.0259◆Bcl-2/Bax 1.6858±0.1941▼▽0.8332±0.0695▼▽1.3954±0.1567▽1.3986±0.2689▼

图4　不同组别的Bcl-2电泳结果

3　讨论

腺性膀胱炎是一种膀胱黏膜增殖性、化生性病变，其病因及生物学意义目前尚未完全明确，目前认为其主要原因是尿路慢性感染。而大肠埃希菌是最常见的致病菌，可黏附于尿路上皮，从而避免被尿流冲刷，感染力更强，更容易导致腺性膀胱炎的发生。并且大肠埃希菌内毒素能诱发膀胱黏膜细胞脱落类似细胞凋亡［4］。而现代对腺性膀胱炎的治疗多采用化疗药物膀胱灌注，但此治疗方法不能减轻患者症状，甚至有些患者灌注后尿路刺激症状加重，让很多病人难以接受或者不能坚持治疗。随着现代医学对疾病的研究逐步深入，越来越多的学者对腺性膀胱炎电灼术后行膀胱灌注化疗的科学性、有效性提出了质疑，化疗药物不仅仅对炎性细胞具有杀灭作用，对正常细胞也有杀灭作用。本课题组自制马归液具有抗菌、抗肿瘤、消炎止痛、止血等作用，以往研究也表明了［5］其对腺性膀胱炎是具有很好的疗效的。

本次实验病理学检验结果再次证明马归液对腺性膀胱炎具有明确疗效，炎性细胞消失，组织恢复正常，与正常大鼠膀胱黏膜对比，无明显差异；而经吡柔比星化疗药物灌注的大鼠膀胱黏膜，虽未见炎性细胞，但黏膜未见恢复；且透射电镜结果从形态学上更加证明了这一点：马归液与吡柔比星均有抑制及杀灭炎性细胞的作用，但是吡柔比星对膀胱组织细胞不仅不具有修复作用而且具有杀伤作用，并出现细胞畸形、凋亡；而马归液组对膀胱组织未见损伤。

细胞凋亡是由多种相关基因和其蛋白调节，而调控细胞凋亡的关键分子是Bcl-2家族蛋白，其中与细胞凋亡关系最紧密的凋亡调控基因是Bcl-2、Bax［6-7］。Bcl-2是抑制凋亡基因；Bax是促凋亡基因，并具有拮抗Bcl-2抑制细胞凋亡的作用。Bcl-2和Bax的比率直接关系到细胞凋亡的进程以及对机体的影响［8］；也有研究表明［9］Bcl-2可以阻止线粒体释放细胞色素C到细胞质，通过抑制Caspase蛋白的水解从而达到了抑制细胞凋亡，是一种较为肯定的抗凋亡基因。而Bax蛋白是与Bcl-2相关X蛋白，是Bcl-2的显性抑制因子，是促进细胞凋亡基因的代表，Bax和Bcl-2相互形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能。Bax和Bcl-2成为了细胞凋亡的正负调控，两者比例决定了细胞凋亡的走向［10］。若Bcl-2/Bax［11］比例增高，则抑制细胞凋亡。反过来，则促进细胞凋亡。

本研究表明，在吡柔比星组中Bax、Bcl-2平均灰度，与生理盐水组相比，结果显示，Bax的蛋白及基因的表达量明显上升趋势，而Bcl-2的蛋白及基因的表达量则降低；且Bcl-2/Bax的比例与生理盐水组相比较明显降低，说明使用吡柔比星进行膀胱灌注时，加速细胞凋亡。而在马归液1组、2组中Bax、Bcl-2平均灰度，结果显示，与生理盐水组相比，Bax的蛋白及基因的表达量明显降低趋势，而Bcl-2的蛋白及基因的表达量则增多；且Bcl-2/Bax的比例与生理盐水组、吡柔比星组相比较明显上升，说明使用马归液进行膀胱灌注时，细胞凋亡功能被抑制；马归液1组与马归液2组相比较，显示马归液2组细胞凋亡抑制效果优于马归液1组。由此可见吡柔比星化疗药物不仅对炎症细胞具有杀灭作用，而且对正常细胞组织也有促进凋亡的作用，而马归液不但对炎症细胞具有杀灭作用，还对正常细胞具有抑制凋亡的作用。

综上所述，本次实验成功构建腺性膀胱炎大鼠模型，为腺性膀胱炎的病因预防有一定的指导作用，同时为腺性膀胱炎的药物治疗研究提供了一种新的思路；本课题还从细胞凋亡角度，以Bcl-2/Bax为指标，研究结果显示自制中药马归液对腺性膀胱炎具有明显的疗效；与化疗药物相比，无明显疗效差异，均具有消炎作用；但其在安全性上明显优于化疗药物，具有抑制细胞凋亡可能性，而且具有药理作用广泛、组织毒性小、安全范围大等特点，其原材料为纯植物，生产简单，技术要求低；其制备工艺简单、经济，因而更具有临床实用价值，值得更加深入探究。

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（本文编辑李杰）

Effect of M agui Liquid on the Expression of Bcl-2 and Bax in Bladder Tissue of Rats w ith Cystitis Glandularis

CAIWei，XIE Haiping，LONG Li，XIE Xiao，YANG Huawei
（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.010

2015-10-16

湖南省自然科学基金项目（13JJ5029）；湖南省教育厅优秀青年项目（15B175）。

蔡蔚，女，博士，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中医药防治泌尿系疾病。