乳酸菌发酵混合蔬菜的初步研究

李　雪，和兴萍，陈　丹，赵声兰*

（1.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500；2.云南省烟草质量监督检测站，云南 昆明 650106）

乳酸菌发酵混合蔬菜的初步研究

李雪1，和兴萍1，陈丹2，赵声兰1*

（1.云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500；2.云南省烟草质量监督检测站，云南 昆明 650106）

采用单因素试验和正交试验，研究并优化混合蔬菜乳酸菌发酵工艺，确定适宜的工艺参数，并对发酵液的感官、酶活、理化指标进行检测。结果表明，优化的乳酸菌发酵混合蔬菜的发酵条件为加糖量40%，嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1.5∶1.0，接种量3.00%，发酵时间20 d，发酵产品中淀粉酶活28.74 U/mL，超氧化物歧化酶活45.63 U/mL，蛋白酶活51.66 U/mL，总多酚4.52 mg/mL，总黄酮63.40 mg/mL，总糖344.38 g/L，还原糖291.25 g/L，总酸8.48 g/L，亚硝酸盐含量为0.16 mg/kg，感官评分为88分。该发酵产品具有一定的营养价值和保健功效。

乳酸菌；发酵；混合蔬菜；酶活；工艺

乳酸菌是传统发酵食品中的菌种，是存在于人类和动物体内的肠道益生菌群［1］。果蔬经乳酸菌发酵后产酸、生香，可改善口感和风味，同时产生多种功能性物质，具有改善营养状况、肠道消化、抑制有害菌和延长保质期等作用［2-4］。近年来，国内外都加强了乳酸菌发酵食品中理化及功能活性的研究［5-6］。本研究选用新鲜芹菜、薄荷、白菜、卷心菜等为原料，加入乳酸菌进行发酵，采用单因素试验研究蔗糖添加量、发酵时间、接种嗜热链球菌（Streptococcus themophilus）与保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）配比和接种量对乳酸菌发酵混合蔬菜发酵液酶活和感官评价的影响；以发酵产品的淀粉酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的酶活及感官评价为指标，采用正交试验并运用隶属度综合评分法优化发酵工艺［5］。对发酵产品蛋白酶酶活、淀粉酶酶活、SOD酶活、总糖、总酸、总黄酮、总多酚等指标分析检测［7-8］，以及抑菌检测和感官评价，增加产品的保健功效，促进人体对营养物质的吸收［9-10］。实验为混合蔬菜乳酸菌发酵及蔬菜酵素的制备和生产奠定了科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜芹菜、薄荷、白菜、卷心菜等蔬菜：购于昆明菜市场。

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb）、嗜热链球菌（Streptococcus themophilus，St），云南中医学院功能食品实验室提供，使用前用20%无菌水配制成10 mg/mL菌悬液。

酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚、无水亚硫酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris、NaOH、HCl、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、邻苯三酚、L-酪氨酸、酪素（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

CP214型电子天平：奥豪斯仪器上海有限公司；SC-3614型低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1800PC紫外-可见分光光度计：翱艺仪器上海有限公司；SW-CJ-2D型超净工作台：苏州净化设备有限公司；LDZX-40BI灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3试验方法

1.3.1乳酸菌发酵混合蔬菜工艺流程

操作要点：取蔬菜切碎，充分混匀后称取150 g，加入不同质量的蔗糖，并且按比例接种一定量的St和Lb，充分混匀后置于250 mL三角瓶密封，避光，室温发酵。

1.3.2单因素试验

固定食盐添加量0.2%，研究蔗糖添加量（20%、25%、30%、35%、40%）、St∶Lb（0.5∶1.0、1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.0∶1.0、2.5∶1.0）和接种量（1.50%、2.25%、3.00%、3.75%、4.50%）对乳酸菌发酵混合蔬菜发酵液酶活和感官评价的影响。

1.3.3正交试验优化发酵工艺条件

采用L9（34）正交试验，以发酵产品的淀粉酶、蛋白酶、SOD酶活及感官评分为评价指标，运用隶属度综合评分法优化发酵工艺条件［5］，正交试验因素与水平见表1。

表1　发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.4分析检测

淀粉酶活测定采用3，5-二硝基水杨酸法［11］。淀粉酶活定义：1mL（或1g固体酶）液体酶在40℃条件下1 min水解1%淀粉产生1mg麦芽糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U）。

蛋白酶活测定采用国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中的福林酚法［12］。蛋白酶活力定义：1 mL液体酶（或1 g固体酶粉），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位（U）。

SOD酶活测定［13］采用邻苯三酚自氧化法。SOD酶活定义为：在一定条件下，反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位（U）。

还原糖和总糖测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法［14］，总酸测定采用国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；总多酚测定采用福林-酚比色法［15］，总黄酮测定采用Al（NO3）3比色法；亚硝酸盐的测定采用国标GB 5009.33— 2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》中盐酸萘乙二胺法对亚硝酸盐进行测定。

1.3.5发酵液的感官评价

从色泽、气味、口感及组织状态进行发酵液的感官评价，评价标准见表2，满分100分。

表2　发酵液的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standard of fermentation liquid

2　结果与分析

2.1加糖量及发酵时间对发酵液淀粉酶活和感官评分的影响

不同蔗糖添加量对乳酸菌发酵混合蔬菜发酵液淀粉酶活和感官评分的影响见图1及图2。

图1　不同蔗糖添加量及发酵时间对淀粉酶活力的影响Fig.1 Effects of different sugar addition and fermentation time on amylase activity

图2　不同蔗糖添加量对发酵液感官评价的影响Fig.2 Effects of different sugar addition on the sensory evaluation of fermentation liquid

由图1可知，发酵液中淀粉酶活随加糖量增加而增加；发酵20 d淀粉酶活最高，20 d后随发酵时间的增加淀粉酶活下降。由图2可知，发酵液的感官评分随加糖量增加而增加；加糖量为35%时，感官评分最高为81分；加糖量＞35%时，感官评分有所下降。因此，最佳加糖量为35%，发酵时间为20 d。

2.2不同接种比例对发酵液淀粉酶活和感官评分的影响

不同St∶Lb比例对乳酸菌发酵混合蔬菜发酵液淀粉酶活和感官评分的影响结果见图3。由图3A可知，发酵时间＜10 d时，发酵液淀粉酶酶活的高低顺序为St∶Lb=2.5∶1.0＞2.0∶1.0＞0.5∶1.0＞1.0∶1.0＞1.5∶1.0；发酵30 d时，发酵液淀粉酶酶活的高低顺序为St∶Lb=1.0∶1.0＞2.0∶1.0＞0.5∶1.0＞2.5∶1.0＞1.5∶1.0。除St∶Lb=2.5∶1.0外，同一接种比例，发酵时间＜10 d，发酵液中淀粉酶酶活随发酵时间增加而增加，之后随发酵时间增加，酶活缓慢降低，但发酵时间＞15 d后，发酵液中淀粉酶酶活又随发酵时间的增加而增加。由图3B可知，St∶Lb=1.0∶1.0的接种比例，发酵液的感官评价得分最高（84分）。因此，最佳St∶Lb接种比例为1.0∶1.0。

图3　不同接种比例对淀粉酶活（A）及感官评分的影响（B）Fig.3 Effects of different inoculation proportion on amylase activity（A）and sensory evaluation（B）

2.3接种量对发酵液淀粉酶活和感官评分的影响

接种量对发酵液淀粉酶活的影响结果见图4。由图4A可知，发酵初期接菌量对发酵液淀粉酶活的影响很小，但发酵时间＞15 d后，接菌量对发酵液淀粉酶活的影响增大，发酵至20 d，发酵液淀粉酶活达到最大，而且发酵液淀粉酶酶活的高低顺序为接种量3.00%＞2.25%＞4.50%＞3.75%＞1.50%，其中接种量为3.00%时，淀粉酶活性最大为42.293 U/mL。由图4B可知，接种量在1.50%～3.00%时，感官评分随接种量增加而增大；并在接种量为3.00%时，感官评分最高81分；接种量＞3.00%之后，感官评分随之下降。因此，最佳接种量为3.00%。

图4　不同接种量对淀粉酶活（A）及感官评分的影响（B）Fig.4 Effects of different inoculum on amylase activity（A）and sensory evaluation（B）

2.4正交试验结果与分析

以发酵液的淀粉酶、蛋白酶、SOD酶活以及感官评价为评价指标，运用隶属度综合评分优化影响因素加糖量（A）、St∶Lb比例（B）及接种量（C）。L9（33）正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

表3　发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

由表3、表4可知，对淀粉酶活影响的主次顺序为A加糖量＞C接种量＞B接菌比例，加糖量对淀粉酶活有显著影响；对蛋白酶活影响的主次顺序为C接种量＞B接菌比例＞A加糖量，对SOD酶活及感官评分影响的主次顺序均为C接种量＞A加糖量＞B接菌比例，接种量对蛋白酶和SOD酶的酶活影响显著，加糖量和接种量对发酵产品的感官有极显著影响。以淀粉酶、蛋白酶、SOD酶为评价指标，加糖量对蛋白酶活影响显著（P＜0.05），接种量对蛋白酶、SOD酶活影响显著（P＜0.05）。以感官评分为评价指标，加糖量及发酵时间对结果影响极显著（P＜0.01）。

表4　正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5乳酸菌发酵混合蔬菜最优工艺参数的确定

表5　隶属度综合评价结果Table 5 Results of comprehensive evaluation of membership degree

工艺优化以淀粉酶活、蛋白酶活、SOD酶活及感官评价四项指标的综合评分为最终的响应值，运用隶属度综合评分法［5］和赋予的权重进行加权求和得到各实验样本的综合评分结果见表5，其中确定指标的权重系数为淀粉酶活0.4，蛋白酶活0.2，SOD酶活0.25，感官评价0.15，隶属度L=（Ci-Cmin）/（Cmax-Cmin），Ci为指标值，Cmin为指标最小值；Cmax为指标最大值。

由表5可知，以综合评分为最终响应值优化到的最优工艺发酵参数为A3B3C2，即加糖量40%，St∶Lb=1.0∶2.0，接种量3.00%。

2.6产品质量分析

感官指标：发酵产品味道浓香，色泽鲜亮，体系均一，口感饱满、绵柔润滑、酸甜适口，没有悬浮物或沉淀，没有不良味道。

理化指标：发酵产品的淀粉酶活28.735 U/mL，SOD酶活45.634U/mL，蛋白酶活51.657U/mL，总多酚4.521mg/mL，总黄酮63.400mg/mL，总糖344.375g/L，还原糖291.250 g/L，总酸8.475 g/L，亚硝酸盐含量为0.160 mg/kg（符合发酵蔬菜的国标准要求≤20 mg/kg），感官评分为88分，可溶性固形物含量30%，pH值为3。

3　结论

本研究采用单因素及正交试验，达到最优工艺发酵参数为加糖量40%、嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1.5∶1.0、接种量3.00%。发酵产品的感官指标及理化指标满足相关国标要求。该发酵产品酸度适当，口感良好，并具有一定的酶活及黄酮、多酚等功效成分，有效地增加了产品功效。

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Preliminary research of lactic acid bacteria fermentation of mixed vegetables

LI Xue1，HE Xingping1，CHEN Dan2，ZHAO Shenglan1*
（1.College of Traditional Chinese Medicine，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China；2.Yunnan Tobacco Quality Supervision and Inspection Station，Kunming 650106，China）

The lactic acid bacteria fermentation technology of mixed vegetables was research and optimized by single factor and orthogonal experiments.The optimal process parameters were determined and the sensory，enzyme activity，the physical and chemical indicators of fermentation liquid were detected.The results showed that the optimum fermentation conditions were sugar 40%，inoculum 3.00%（Streptococcus thermophilus∶Lactobacillus bulgaricus=1.5∶1.0），fermentation time 20 d.Under the conditions，the activity of amylase，superoxide dismutase and protease were 28.74 U/ml，45.63 U/ml，and 51.66 U/ml，respectively.The content of total polyphenols，total flavonoids，total sugar，reducing sugar，total acid and nitrite were 4.52 mg/ml，63.40 mg/ml，344.38 g/L，291.25 g/L，8.48 g/L and 0.16 mg/kg.The sense score was 88.The fermented product had a certain nutritional value and healthy efficacy.

lactic acid bacteria；fermentation；mixed vegetables；enzyme activity；process

TS205.5

0254-5071（2016）09-0176-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.040

2016-01-30

云南省教育厅重大专项（ZD2014009）

李雪（1991-），女，硕士研究生，研究方向为中药资源开发与利用。

赵声兰（1962-），女，教授，硕士，研究方向为药食资源开发与利用研究。