高效液相色谱法测定车厘子中果糖、葡萄糖及蔗糖含量

毛善巧，杨　锋，黄永春

（1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006）

高效液相色谱法测定车厘子中果糖、葡萄糖及蔗糖含量

毛善巧1，2，3，杨锋1，2，3，黄永春1，2，3

（1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006）

采用高效液相色谱法（HPLC）测定车厘子中果糖、葡萄糖及蔗糖的含量。测定方法：Shodex SUGAR系列KS-801（钠型）色谱柱（8 mm×300 mm，6 μm）、流动相为超纯水，流速0.8 mL/min，柱温80℃，示差折光检测器（RID）温度30℃，进样量20 μL，外标法定量。该法对果糖、葡萄糖和蔗糖测定的平均回收率分别为99.96%、100.30%、99.26%，相对标准偏差（RSD）分别为1.54%、0.49%、0.48%，检出限分别为3.50 μg/mL、4.88 μg/mL、7.50 μg/mL，果糖、葡萄糖和蔗糖的标准曲线相关系数均在0.999以上（n=5）。该法可快速准确的对果糖、葡萄糖和蔗糖定性、定量分析。结果表明，车厘子果肉中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量分别为5.69%、5.83%、0.24%。

车厘子；高效液相色谱法；测定；蔗糖；葡萄糖；果糖

车厘子［1］是近年来从美国进口的一种水果，其价格昂贵，被誉为“水果中的钻石”。车厘子果肉细腻爽口，汁水浓郁，甜嫩鲜美［2］，营养价值高，医疗保健价值更高［3］，车厘子含铁量高，能够促进血红蛋白再生，对贫血患者有一定的补益作用，且性温、味甜，有调中益脾、调气活血、平肝祛热之功效。车厘子除了鲜食，还可以腌制或用于发酵饮料［4］和药酒制备［5］。车厘子中富含糖分，但其糖分种类及含量尚少见报道。水果中常见含量较高的糖分有蔗糖、葡萄糖和果糖。蔗糖是人们日常生活重要的营养物质之一，但过多摄入蔗糖有可能导致肥胖、龋齿、糖尿病等；葡萄糖是生命活动中不可缺少的物质，在人体内能直接参与新陈代谢过程；果糖的口感和甜度优于其他糖且升糖指数低［6］，被称为“健康糖”。目前，测定糖类物质的方法主要有化学法［7-8］、近红外光谱法［9-10］、气相色谱法［11］、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［12-18］等。以上方法中，化学法主要用于测定总糖，且误差较大；近红外光谱法的精确度难以达到HPLC法；气相色谱法测定糖类物质需要衍生，步骤比较繁琐。HPLC法测定糖类物质具有快速、准确等诸多优势，已被广泛应用于［15-19］食品、饮料、水果中糖类物质的分析检测，是目前监测糖类物质的常用手段。

该实验采用糖类化合物分析专用柱，建立了一种能同时测定果糖、葡萄糖、蔗糖含量的HPLC法。以该法准确测定车厘子中果糖、葡萄糖及蔗糖的含量，为车厘子深加工奠定基础，同时也为取材车厘子的研究提供可靠依据，对车厘子产业的发展及应用都十分有意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

蔗糖、葡萄糖、果糖标准品（纯度均≥99.5%）：北京世纪奥科生物技术有限公司；新鲜车厘子：本地超市所购买；实验室用水为超纯水和去离子水。

1.2仪器与设备

Waters 1515pump系列高效液相色谱仪（具有针孔进样器）：美国Waters公司；Universal 32R高速台式冷冻离心机：德国Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1高效液相色谱分析条件

Shodex SUGAR系列KS-801（钠型）色谱柱（8 mm× 300 mm，6 μm）；流动相为超纯水；柱温80℃；检测池温度30℃；检测器灵敏度为4 mV；流速0.8 mL/min，进样量20 μL。

1.3.2标准溶液的配制

精确称取果糖和葡萄糖标准品各0.500 0 g、蔗糖标准品0.100 0 g，分别用超纯水定容于50 mL容量瓶中。用移液管分别准确吸取果糖和葡萄糖标准液1 mL、2 mL、4 mL、6mL、8mL，全部定容至10mL；分别吸取蔗糖标准液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，全部定容至50 mL。配制得到果糖和葡萄糖质量浓度为1.00 g/L、2.00 g/L、4.00 g/L、6.00 g/L、8.00g/L，蔗糖质量浓度为0.04g/L、0.08g/L、0.12g/L、0.16g/L、0.20 g/L的标准系列。上机前均过0.45 μm滤膜。

1.3.3样品溶液制备

按照文献［2］中的方法挑选新鲜优质的车厘子，去核捣碎。按照文献［14］的方法提取糖类物质，方法修改后简述如下：称取2.50g捣碎后的样品，用10mL体积分数为80%的乙醇溶液研磨，10 000 r/min离心10 min，残渣加入5 mL提取液再提取，合并上清液，90℃水浴蒸干，定容至50 mL，摇匀，静置备用。上机前经0.45 μm滤膜过滤。

1.3.4糖含量计算方法

式中：W为糖含量，%；C0为糖分质量浓度，g / L；V为样品溶液体积，m L；m为样品质量，g。

2　结果与分析

2.1色谱条件的选择

2.1.1色谱柱及流动相的选择

采用高效液相色谱法测定蔗糖、葡萄糖及果糖的文献中大多采用氨基键合柱［17］，其流动相为一定比例的乙腈和水。乙腈是一种易挥发的有毒致癌物质，容易对研究人员的身体造成伤害，处理不当还会污染环境；氨基柱固定相上的氨基易与还原糖（葡萄糖、果糖）发生反应，不仅影响柱子寿命［19］，还可能对还原糖的定量分析产生影响。该实验采用Shodex SUGAR系列KS-801（钠型）色谱柱，以超纯水为流动相，消除以上隐患。

2.1.2色谱柱柱温的选择

Shodex SUGAR系列KS-801（钠型）色谱柱为高温柱，分析时至少要选择60℃以上的柱温，但不能超过85℃，因为温度过低时水的黏度会比较高，带来很高的反压容易损坏色谱柱，而温度过高，会破坏色谱柱的填料。将柱温为60℃、70℃、80℃时色谱柱对蔗糖、葡萄糖、果糖标准品混合液（蔗糖∶葡萄糖∶果糖=10∶0.7∶0.3）的分离效果进行了对比，结果见图1。由图1可知，柱温为80℃时各峰峰形最好，故选择柱温为80℃。

图1　不同柱温条件下高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of different column temperature

2.1.3流动相流速的选择

色谱柱工作时能承受最大的反压是5 MPa（≈725 psi），在使用中发现流速越大，反压越大，当流速达到0.9 mL/min，反压达到682psi。故选择流速分别为0.5mL/min、0.6mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min考察流速对分离效果的影响，结果见图2。由图2可知，流速对蔗糖、葡萄糖、果糖混合液（蔗糖∶葡萄糖∶果糖=2∶1∶1）的分离效果影响不大，但流速越大，分离速度越快，流速为0.5mL/min时，采集时间需要17min，流速为0.6mL/min时，需要14 min，流速为0.7 mL/min时，需要12 min，流速为0.8 mL/min时，需要11 min，为了提高工作效率，选择流速为0.8 mL/min。

图2　不同流速下高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of different flow velocity

2.1.4检测器及其参数的选择

蔗糖、葡萄糖、果糖在结构上没有紫外吸收基团，因此不能选择紫外分光光度检测器检测，示差折光检测器是根据样品流路与参比流路之间折射率的变化以测定样品浓度的通用检测器，适用于糖类检测，但对温度变化敏感［20］，要求高于室温5～10℃。实验采用示差检测器检测，检测池温度设为30℃。检测器灵敏度的选择范围为1～1 024 mV，灵敏度越大，信号响应值越高，但噪音也越大，综合考虑，灵敏度设置为4 mV。

2.2样品定性分析

分别将蔗糖、葡萄糖、果糖的某一质量浓度标准液重复进样5次，记录保留时间和峰面积，然后进混合标准液，考察最终色谱条件的分离效果。再将样品溶液进样5次，记录保留时间和峰面积，根据保留时间对样品各峰定性，各标准液和样品对应峰的保留时间见表1，混合标准液和样品色谱图见图3。

图3　混合标准液（a）和样品（b）高效液相色谱图Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution（a）and sample（b）

由表1及图3可知，蔗糖、葡萄糖及果糖标准品的出峰时间分别为7.558 min、9.195 min、9.823 min，样品中峰1、2及3中的出峰时间分别为7.554 min、9.177 min、9.799 min，由此确定样品中峰1为蔗糖峰，峰2为葡萄糖峰，峰3为果糖峰。在图2b中，峰1的保留时间之前有一未知峰，按照色谱柱分离原理［21］，确定该未知峰的分子质量远大于蔗糖分子质量，该未知物可能是车厘子中的水溶性好的多糖或者其他杂质，在此不做讨论。

表1　蔗糖、葡萄糖、果糖标准品和样品各峰的保留时间Table 1 Retention time of sucrose，glucose，fructose standard solution and each peak of the sample　min

2.3标准曲线的建立

将各级标准溶液使用0.45 μm微孔滤膜过滤上机进样，进样20 μL，以标样峰面积（y）为纵坐标、标样质量浓度（x）为横坐标，使用工作站Breeze version 3.30绘制标准曲线，拟合线性回归方程，按信噪比S/N=3计算出各组分检测限，结果见表2。由表2可知，该方法蔗糖、葡萄糖、果糖的检出限分别为：蔗糖7.50 μg/mL，葡萄糖4.88 μg/mL，果糖3.50 μg/mL。果糖、葡萄糖及蔗糖的标准曲线相关系数R2均大于0.999，说明在所取范围内线性良好。

表2　标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围和检出限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges and detection limits

2.4精密度试验

按样品测定方法，吸取蔗糖质量浓度为0.16 g/L、葡萄糖质量浓度为6.00 g/L、果糖质量浓度为4.00 g/L的标准溶液进行精密度实验，分别连续进样5次，测定其峰面积，计算峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）考察该方法的精密度，结果见表3。

表3　精密度试验结果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，3种糖的RSD值分别为蔗糖0.48%、葡萄糖0.49%、果糖1.54%，均＜5%，表明该方法精密度高。

2.5回收率试验

采用加标样回收法，取4份5 mL样品溶液，一份加入5 mL去离子水，另外3份分别加入5 mL蔗糖、葡萄糖、果糖标准液，标准液质量浓度分别为蔗糖0.04 g/L，葡萄糖2.00 g/L，果糖2.00 g/L。平行测定5次，计算平均值，结果见表4。结果表明，蔗糖、葡萄糖、果糖的平均回收率分别为99.26%、100.03%、99.96%，说明该方法具有较高的准确度。

表4　加标回收率试验结果Table 4 Results of standard addition recovery tests

2.6重复性试验

分别配制5份样品溶液，分别测得峰面积，然后根据回归曲线峰面积与浓度的关系式计算样品中蔗糖、葡萄糖、果糖质量浓度，以5次测定值考察该方法的重复性，结果见表5。由表5可知，重复性试验结果RSD为0.59%～1.02%，表明该法重现性良好。

表5　重复性试验结果Table 5 Results of reproducibility tests　g/L

2.7样品中蔗糖、葡萄糖、果糖含量的测定

按照1.3.1中色谱条件，将样品溶液过滤后进样，测定果糖、葡萄糖、蔗糖的色谱峰峰面积，代入标准曲线分别计算样品中各糖分的质量浓度，以1.3.4中计算公式计算样品中各糖分的质量分数。结果见表6。

表6　车厘子中糖类物质种类及质量分数Table 6 Type and mass fractions of sugars in cherry

3　结论

通过对色谱条件的筛选建立了用Shodex SUGAR系列KS-801（钠型）色谱柱测定蔗糖、葡萄糖及果糖的HPLC方法。标准曲线相关系数R2均大于0.999，对精密度、回收率及重复性试验的考察证明该方法准确可靠。此法对蔗糖、葡萄糖、果糖标准混合液分离效果良好，可快速准确的对样品中蔗糖、葡萄糖及果糖定性、定量分析。该实验对车厘子中的蔗糖、葡萄糖及果糖进行测定，结果表明：车厘子中蔗糖、葡萄糖和果糖的总含量达11.76%，其中果糖和葡萄糖含量较高，分别为5.69%和5.83%，蔗糖含量较少，只有0.24%。

［1］薛理勇.车厘子［J］.食品与生活，2011（4）：24-24.

［2］苏娟.水果中的钻石车厘子［J］.中国果菜，2015（3）：20-20.

［3］何江，伍玲，谢艳，等.魔芋葡甘聚糖涂膜和加速器辐照对车厘子冷藏保鲜研究［J］.湖北农业科学，2015，（54）20：5121-5124.

［4］张雪利.一种车厘子杂粮发酵饮料及其制备方法，CN104872752A［P］. 2015-09-02.

［5］叶书平.一种车厘子保健药酒制备方法，CN104450456A［P］.2015-03-25.

［6］马永刚.果糖在天然甜味剂中的诸多优势［N］.中国食品报，2011-10-17005.

［7］文赤夫，董爱文，李国章，等.蒽酮比色法测定紫花地丁中总糖及还原糖含量［J］.现代食品科技，2005，21（3）：122-130.

［8］王俊刚，张树珍，杨本鹏，等.3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量［J］.甘蔗糖业，2008（5）：45-49.

［9］曹干，周学秋.近红外光谱法快速测定甘蔗蔗汁蔗糖分［J］.甘蔗，2001（3）：20-25.

［10］饶震红，李民赞，吉海彦.短波近红外光谱法同时定量分析水溶液中葡萄糖、果糖和蔗糖［J］.光谱学与光谱分析，2006，26（4）：633-635.

［11］贺永惠，王清华，刘长忠，等.乙酸酐衍生化气相色谱法测定小麦非淀粉多糖的单糖组成［J］.光谱实验室，2009，26（4）：1039-1042.

［12］刘玉峰，李黎，李东，等.高效液相色谱法测定食品中的单糖、双糖［J］.食品科学，2007，28（3）：293-296.

［13］田艳铃，王浩，刘艳琴，等.HPLC示差折光分析法测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖含量［J］.中国食品添加剂，2006（6）：187-189.

［14］刘胜辉，魏长宾，孙光明，等.高效液相色谱法测定台农6号菠萝果实中的糖分［J］.食品科学，2009，30（12）：162-164.

［15］逯平杰，代容春，叶冰莹，等.高效液相色谱法测定甘蔗节间果糖，葡萄糖和蔗糖的含量［J］.食品科学，2011，32（2）：198-200.

［16］汪良清，胡桂标.液相色谱-示差折光法测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的改进研究［J］.中国酿造，2013，32（6）：154-156.

［17］李映志，刘胜辉，朱祝英，等.高效液相色谱法测定菠萝蜜果实中的葡萄糖、果糖和蔗糖［J］.食品科学，2014，35（12）：84-87.

［18］FILIP M，VLASSA M，COMAN V，et al.Simultaneous determination of glucose，fructose，sucrose and sorbitol in the leaf and fruit peel of differentapplecultivarsbytheHPLC-RIoptimizedmethod［J］.Food Chem，2016，199：653-659.

［19］林月绪，张华，陈如凯.HPLC-RID测定甘蔗茎节蔗糖、葡萄糖和果糖含量［J］.福建农林大学学报：自然科学版，2015，44（3）：232-235.

［20］龚时琼.高效液相色谱仪常用检测器的使用与维护［J］.现代仪器，2009，15（1）：55-56.

［21］张义平，浦媛媛，邹青松，等.HPGPC柱串联法测定肠膜明串珠菌发酵产物研究［J］.食品科技，2013，38（10）：308-312.

Determination of fructose，glucose and sucrose contents in cherry by HPLC

MAO Shanqiao1，2，3，YANG Feng1，2，3，HUANG Yongchun1，2，3
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes，Liuzhou 545006，China）

HPLC was used to determine the content of fructose，glucose and sucrose in cheery.The operating conditions were confirmed as follows：ShodexSUGARseriesKS-801（Na+）column（8mm×300mm，6 μm），which washeld ata constanttemperature of 80℃，usinga mobile phase composed of pure water at a flow rate of 0.8 ml/min.The refractive index detector temperature was set as 30℃and injection volume 20 μl.The average recovery of fructose，glucose and sucrose determination rate were 99.96%，100.30%，and 99.26%，respectively，the relative standard deviation（RSD）were 1.54%，0.49%，and 0.48%，respectively，and the detection limits were 3.50 μg/ml，4.88 μg/ml，7.50 μg/ml，respectively.The correlation coefficients of sucrose，glucose and fructose were all above 0.999（n=5）.The method can be used for qualitative and quantitative analysis of fructose，glucose and sucrose quickly and accurately.The results showed that the percentage composition of fructose，glucose and sucrose in cheery were 5.69%，5.83%，0.24%.

cheery；high performance liquid chromatography；determination；sucrose；glucose；fructose

O657.7

0254-5071（2016）09-0168-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.038

2016-06-28

国家自然科学基金项目资助（31160348）；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助（桂教人〔2014〕7号）；广西科技大学创新团队支持计划资助；广西高校糖资源加工重点实验室开放课题（2015TZYKF04）

毛善巧（1991-），男，硕士研究生，研究方向为糖资源加工技术及过程强化。