霍氏肠杆菌A20降解类胡萝卜素的条件优化

杨雪鹏，汪芳芳，崔君竹，叶建斌，马　科

（郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001）

霍氏肠杆菌A20降解类胡萝卜素的条件优化

杨雪鹏，汪芳芳，崔君竹，叶建斌，马科

（郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001）

为了提高类胡萝卜素的降解率，以霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）A20菌株为对象，研究其培养条件（培养时间、培养温度、转速、pH值、接种量）对类胡萝卜素降解率的影响，并通过单因素和正交试验，以降解率为评价指标，确定微生物的最佳培养条件。结果表明，培养条件的改变可以影响类胡萝卜素的降解效果，各培养条件对类胡萝卜素的降解率的影响程度不同。菌株A20降解类胡萝卜素的最佳培养条件为培养时间42 h，温度25℃，转速150 r/min，pH值7.0，接种量1.0%，在此条件下，类胡萝卜素降解率从最初的70.80%提高至91.53%。

类胡萝卜素；降解率；条件优化；正交试验

类胡萝卜素是一类天然存在的脂溶性色素，具有抗氧化性，广泛地存在于蔬菜、水果、鲜花以及一些微生物、昆虫和海洋动物中，是一类重要的香料前体物质［1］。现在在自然界中发现了的类胡萝卜素已经有600多种［2］。类胡萝卜素属于四萜类化合物，典型的类胡萝卜素由8个异戊二烯首尾相连构成，其分子结构中因存在较多的类异戊二烯共轭双键，故具有较强的吸光性能，呈现出橙、黄、红色［3］。

类胡萝卜素的性质极不稳定，与氧气在常温条件下接触可发生氧化反应，7、8及9、10位的双键最易发生氧化断裂，产物多为含C9～C13之间的醛酮［4］。氧化降解时，类胡萝卜素因双键断裂位置的不同，而产生不同的化合物，并进一步转化形成多种重要的香气物质［5］。如类胡萝卜素降解可产生β-紫罗兰酮、β-大马酮和巨豆三烯酮等芳香物质，这些芳香物质是植物花香和果香的来源［6］，且这些化合物还呈现出烟草特有的香味，在制备香精香料方面具有重要价值［7］。

类胡萝卜素的降解方法主要有物理降解，化学降解和生物降解法。目前关于类胡萝卜素降解的报道主要集中于物理降解和化学降解，而生物降解法尤其是利用酶和微生物来降解类胡萝卜素产生香味物质的研究还很少［8］。根据美国和欧盟的法律，生物降解将成为一个很引人瞩目的发展方向，第一，其制得的香气成分被看作是“天然成分”；第二，与化学合成相比，生物法消除了自然界中出现的旋光异构现象，节省了后续的分离步骤［9］，第三，由于手性影响，对香气感官有所改善。ABATE A等［10］指出，香水行业需要的手性化合物需要通过酶催化特别是脂肪酶介导的反应制得。

为了进一步提高类胡萝卜素降解率，促进香味物质的生成，本研究以类胡萝卜素降解菌A20为试验菌株，以类胡萝卜素降解率为指标，应用单因素试验和正交试验分析对发酵条件进行优化，探讨了影响类胡萝卜素降解率的各种关键因素，以期得到发酵的最佳条件。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

类胡萝卜素标准品（纯度90%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；菌株：由前期试验，从烟叶中筛选出了一株能高效降解类胡萝卜素的菌株，通过形态观察、生理生化试验和分子鉴定等手段，鉴定该菌株为霍氏肠杆菌（Enterobacterhormaechei）A20；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、K2HPO4、二氯甲烷、无水乙醇等；所有试剂均为国产分析纯。

培养基：葡萄糖8 g、酵母膏14 g、蛋白胨7 g、K2HPO40.72 g、蒸馏水1 L，pH 7.0，灭菌后，类胡萝卜素溶液使其终浓度为20 g/L，并无菌过滤。

类胡萝卜素溶液：用200 mg的类胡萝卜素分散在2 g吐温-80中，溶解在400 mL二氯甲烷中，将溶剂减压蒸出，溶解在10 mL无水乙醇中［11］。

1.2仪器与设备

BSD-YF3200恒温振荡器：上海福玛实验设备有限公司；1260 infinity高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦科技公司；UV-2300紫外分光光度计：尤尼克（上海）有限公司；GR85DA高压灭菌锅：致微仪器有限公司；Hicen FR高速冷冻离心机：德国Herolab公司。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程及操作要点

配制培养基→灭菌→加入2 mL类胡萝卜素溶液→接种→培养→离心→萃取→浓缩→检测类胡萝卜素质量浓度

将培养好的种子液按1%的接种量接入装液量为100mL 250mL三角瓶中。在30℃、150r/min条件下，避光培养42h。发酵液在避光条件下，4℃6 500 r/min高速离心15 min。取上清液加入等体积的二氯甲烷反复萃取3次，得类胡萝卜素提取物，加无水Na2SO4干燥过夜。45℃真空浓缩，蒸干溶剂，再加2 mL甲醇，过0.45 μm的有机系膜，待高效液相色谱分析，并以等体积不接菌培养基作为对照。

1.3.2单因素试验

在原有发酵工艺基础上，分别考察培养时间（0、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h）、温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、转速（50 r/min、100 r/min、150r/min、200 r/min、250 r/min）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对类胡萝卜素降解率的影响。1.3.3正交试验

表1　类胡萝卜素降解条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for carotenoids degradation conditions optimization

利用单因素试验的方法分析上述试验结果，选取温度、转速、接种量和pH值4个因素进行正交试验设计，各设置3个不同的水平，采用L9（34）正交设计进行试验，各因素与水平见表1。每个试验设置3次重复［12］。

1.3.4测定方法

菌液浓度的测定：取1 mL发酵液稀释3倍，用紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的吸光度值，即OD600nm值。

［13］中HPLC分析条件、绘制类胡萝卜素标准曲线，并根据标准曲线线性回归方程计算发酵液中胡萝卜素的质量浓度。

类胡萝卜素降解率的测定：按照参考文献［13］的方法进行测定。以不加菌株A20的培养基为对照组。其计算公式为：

式中：C试验为试验组中类胡萝卜素的质量浓度，mg/L；C对照为对照组中类胡萝卜素的质量浓度，mg/L。

2　结果与分析

2.1类胡萝卜素标准曲线的绘制

按照参考文献［13］的色谱条件进行测定，类胡萝卜素标准曲线如图1所示。峰面积（Y）与类胡萝卜素质量浓度（X）的回归方程为Y=43.135X+57.84，相关系数R2=0.997 6，表明在0～200mg/L范围内，类胡萝卜素质量浓度与峰面积线性关系良好。

图1　类胡萝卜素的标准曲线Fig.1 Standard curve of carotenoids

2.2单因素试验结果

2.2.1培养时间优化的结果

图2　菌株A20的生长和降解动力学曲线Fig.2 Growth curve and carotenoids degradation kinetics curve of strain A20

由图2可知，菌株A20在培养18 h后开始迅速繁殖；至36 h时，发酵液OD600nm值达到最高；42 h时，菌株A20对类胡萝卜素的降解基本已经结束。因此，本试验选择42 h为最终降解时间。

2.2.2培养温度优化的结果

图3　不同温度对OD600nm值和类胡萝卜素降解率的影响Fig.3 Effects of different temperature on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由图3可知，在＜25℃时，随温度增加，菌体的代谢加快，加速酶的产生，降解率提高；在25℃时类胡萝卜素的降解率达到78.6%，OD600nm值达到2.668；超过25℃后菌体的代谢受到一定程度的限制，产酶量下降，故降解率有所降低。但在温度40℃时，类胡萝卜素降解率突然提高，可能是因为类胡萝卜素高温发生热裂解。因此，温度过高或者过低都不利于微生物的生长代谢和类胡萝卜素的降解。因此，菌株A20降解类胡萝卜素的最佳发酵温度为25℃［14］。

2.2.3转速优化的结果

图4　转速对OD600nm值和类胡萝卜素降解率的影响Fig.4 Effects of rotate speed on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由图4可知，当转速在50～200 r/min时，随转速的增大，菌株的生物量在逐渐增大，类胡萝卜素的降解率也在提高；当摇床转速为200 r/min时，类胡萝卜素降解率达到最大，为81.5%，OD600nm值为2.75；说明该转速下，发酵培养基中的溶氧量更加有利于菌体的生长，故降解率最高。因此，菌株A20降解类胡萝卜素的最佳摇床转速为200r/min。

2.2.4初始pH值优化的结果

图5　初始pH值对OD600nm值和类胡萝卜素降解率的影响Fig.5 Effects of initial pH on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由图5可知，当pH值在6.0～7.0时，随着pH值的增大，菌株的生物量和类胡萝卜素的降解率也在提高；当pH值在7.0～8.0时，随着pH值的增大，菌株的生物量和类胡萝卜素的降解率反而在降低；当初始pH值为7.0时，菌株的生物量和类胡萝卜素的降解率最高，降解率为81.8%，OD600nm值为2.721。因此，本试验选择的最适pH值为7.0［15］。

2.2.5接种量优化的结果

图6　接种量对OD600nm值和类胡萝卜素降解率的影响Fig.6 Effects of inoculum on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由图6可知，接种量为0.5%～1.5%时，营养物质得到有效的利用，同时酶得到积累，因此降解率大幅提高；当接种量为1.5%时，类胡萝卜素的降解率达到最高，为87.3%，OD600nm值为2.814；但随着接种量的增加，类胡萝卜素的降解率减小，这主要是由于接种量过大，菌体快速生长，营养消耗过快且通氧量不足，使菌株稳定期缩短，快速进入衰老期，不利于酶的产生和积累［16］，从而使类胡萝卜素的降解率下降。因此，本试验选择1.5%为最佳接种量。

2.3正交试验优化结果

类胡萝卜素降解条件优化正交试验结果见表2，方差分析见表3。由表2、表3可知，A（温度）、B（转速）、C（接种量）、D（初始pH值）因素对类胡萝卜素降解率的影响均极显著。因素主次顺序为A＞C＞D＞B。最佳培养条件为A2B1C1D2，即培养温度为25℃，转速150r/min，pH值为7.0，接种量为1.0%，在此条件下进行验证试验，类胡萝卜素降解率为91.53%。

表2　类胡萝卜素降解条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for carotenoids degradation condition optimization

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，培养温度、转速、初始pH值、接种量4个因素对类胡萝卜素降解率均有极显著影响（P＜0.01）。

3　结论

通过单因素试验和正交试验结合的方法对菌株Enterobacter hormaecheiA20降解类胡萝卜素的发酵条件进行优化，确定最佳发酵条件。优化结果表明，菌株A20降解类胡萝卜素的最佳培养条件为培养时间42 h，培养温度25℃，转速150 r/min，pH值7.0，接种量为1.0%。在此条件下，类胡萝卜素降解率从优化前的70.8%提高至91.53%。本试验的菌株A20在条件优化后，能够高效降解类胡萝卜素，产生明显的香味，对于提高商业价值、降低经济成本具有重要意义。

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Optimization of conditions for degradation of carotenoids byEnterobacter hormaecheiA20

YANG Xuepeng，WANG Fangfang，CUI Junzhu，YE Jianbin，MA Ke
（School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China）

In order to improve the degradation rate of carotenoids，withEnterobacter hormaecheiA20 as the object，the effects of culture time，temperature，speed，pH and inoculum on the degradation rate of carotenoids were studied.The optimum culture conditions were determined by single factor and orthogonal experiments with degradation rate as the index.Results indicated that the degradation rate of carotenoids was affected by the culture condition with different influential levels.The optimized culture conditions of the strain were as follows：culture time 42 h，temperature 25℃，rotate speed 150 r/min，pH 7.0，and inoculum 1.0%.Under the condition，carotenoids degradation rate increased from 70.80%to 91.53%.

carotenoids；degradation rate；conditions optimization；orthogonal test

TS201.3

0254-5071（2016）09-0125-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.028

2016-04-25

杨雪鹏（1973-），男，教授，博士，研究方向为烟草工程与酶工程。