海藻糖合成酶产生菌筛选、鉴定及其产酶特性

刘德海，权淑静，解复红，马　焕，巩　涛，贾　彬，陈国参

（1.河南省科学院 生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南 郑州 450008）

海藻糖合成酶产生菌筛选、鉴定及其产酶特性

刘德海1，权淑静2，解复红2，马焕2，巩涛1，贾彬2，陈国参1

（1.河南省科学院 生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南 郑州 450008）

以麦芽糖为唯一碳源高盐培养基，经高温培养，从温泉水样及其附近土壤中筛选得到一株菌株T2，经过生物合成途径初步验证，该菌株产海藻糖合酶，能够通过海藻糖合成酶（TreS）途径将麦芽糖转化为海藻糖。菌株T2为革兰氏阳性菌，杆状，有芽孢，经过生物学鉴定，将其初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。对其产海藻糖合酶的酶学性质进行了研究：酶反应最适作用温度为60℃，在60℃条件下保温100 min仍能保持酶活性80.7%；最适作用pH值为7.0，在pH 6.0～7.5范围内稳定。采用正交试验对其发酵培养基配方进行了优化研究，确定了最佳的培养基组成为牛肉膏3.0 g/L，麦芽糖20.0 g/L，蛋白胨7.5 g/L，无机盐（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此条件下，菌株T2产海藻糖合酶酶活力达到310.6 U/L。

海藻糖；海藻糖合酶；TreS途径；筛选；鉴定

海藻糖（trehalose）是由2个葡萄糖分子以α-1，1糖苷键构成的非还原性糖，具有明显的化学惰性和极强的稳定性［1］，是一种安全的功能性低聚糖［2］，具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结、干燥性等多种生物学功能，而且其对生物体及生物大分有着非特异性良好的非特异性的保护作用［3］，在食品、医学、轻工业领域中被广泛应用［4］，特别是在食品工业中，作为食品添加剂能够防止淀粉老化、防止蛋白质变性、防止脂类物质氧化变质、保持食品原有的色泽、风味、质地、营养等［5-6］，也可用于食品、水果、蔬菜的保鲜［7-8］，有很大的市场需求量［9］。

在不同生物中，海藻糖生物合成主要有三种途径：（1）OtsA-OtsB途径［10］，即以二磷酸尿核苷葡萄糖（Uridine diphosphate-glucose，UDPG）和6-磷酸葡萄糖为底物，通过6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（trehalose-6-phosphatephosphate，TPP）两种酶催化合成海藻糖；（2）TreY-TreZ途径［11］，即以淀粉为底物，利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase，TreY基因编码）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose hydrolase，MTHase，TreZ基因编码）的协同作用，将淀粉转化为海藻糖；（3）海藻糖合酶（trehalose synthase，TreS）途径［12］，即以麦芽糖为底物，利用菌株内特异的海藻糖合成酶分子内转糖基化作用，将麦芽糖转化为α-1，1-糖苷键连接而成的海藻糖。

酶法转化海藻糖一直是工业生产海藻糖的主要途径，TreS途径海藻糖合酶单酶转化法生产海藻糖，可通过转糖基作用直接将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化为α-1，1糖苷键生成海藻糖，反应流程短，非常容易调节和控制，是较为简单的海藻糖生产方法，在工业酶法生产海藻糖中最具优势，在工业化生产海藻糖中具有良好的应用前景［13-15］。

本研究采集河南鲁山上汤温泉水样及其附近土壤，从中分离筛选得到一株产海藻糖的菌株T2，经过生物合成途径初步验证，该菌株含有海藻糖合酶以TreS途径将麦芽糖转化为海藻糖，并对该菌株发酵产海藻糖合酶酶学性质及其发酵培养基优化进行了初步研究，为其工业化发酵生产海藻糖提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

河南鲁山上汤温泉水样及其周围土壤：采用多点随机采样法，取地下5 cm处土壤样品混合，装入无菌袋，风干，研磨过筛，放4℃冰箱中备用。

1.1.2主要试剂

2×ESTaqMasterMix（Dye）：北京康为世纪生物科技有限公司；16S rDNA基因的PCR扩增采用细菌提取扩增通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3，和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）：北京六合华大基因科技股份有限公司；E.Z.N.A.Bacterial DNA kit试剂盒（D3350-01）：美国Omega Bio-Tek公司；溶菌酶Lysozyme（20 000 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖：法国Biowest公司；DNA Marker DL2000：北京康为世纪生物科技有限公司；海藻糖：美国Sigma公司；D-麦芽糖：北京奥博星生物技术有限责任公司；快速革兰氏染色液：珠海贝索生物技术有限公司；糖化酶（100000U/g）：河南仰韶生化工程有限公司；3，5-二硝基水杨酸溶液（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

10 mg/mL溶菌酶溶液：称取溶菌酶1 g，超纯水溶解定容于100 mL容量瓶中。

1.1.3培养基

菌种保藏培养基采用LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，水1 000 mL，pH 7.2。

富集培养基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，水1 000 mL，pH 7.2。

菌种筛选培养基：麦芽糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，K2HPO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，NaCl 50.0 g，琼脂15.0 g，水1 000 mL，pH 7.2。

产酶培养基：麦芽糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，K2HPO41.0g，NaH2PO41.0g，MgSO4·7H2O1.0g，水1000mL，pH 7.2。

1.2仪器与设备

Nikon 50i荧光相差显微镜：日本Nikon公司；Multifuge X1R离心机：德国Thermo公司；ME204E电子天平、FE20实验室pH计：瑞士Mettler Toledo公司；7146超纯水机：美国Thermo公司；DNP-9052电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；QYC-2012C恒温摇床：上海福玛实验设备有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR扩增仪：德国Biometra公司；DYY-6C电泳仪：北京六一仪器厂；T6新世纪紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GF254硅胶板：青岛海洋化工有限公司；薄层层析缸（10 cm×10 cm）：上海楚定分析仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1菌株的筛选、分离纯化

参照参考文献［16］的方法。在无菌条件下用无菌药勺取1.0g样品加入富集培养基中，于37℃、160 r/min振荡培养48 h。将富集后的菌液采用稀释平板法进行稀释，选择适宜的稀释度各吸取0.1 mL涂布于菌种筛选培养基平板上，45℃恒温培养箱中培养48 h，每个稀释度设三个重复，用无菌牙签挑取色泽、外观不同的单菌落交叉划线法于菌种筛选培养基平板上，45℃恒温培养箱中培养36 h进一步分离纯化，挑取分离纯化的单菌落转接于菌种保藏培养基斜面试管上，37℃培养，待长出菌落后，进行记录编号，放4℃冰箱中备用。

1.3.2粗酶液制备

将初筛出的单菌落试管斜面菌种挑取2～3环接种于60 mL发酵产酶培养基中，每250 mL三角瓶中装入60 mL产酶培养基，37℃、160 r/min摇床振荡培养48 h，离心机于4℃、6 000 r/min离心15 min，弃上清液，将获得的菌体泥用50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）振荡洗涤2～3次，收集湿菌体泥。

溶菌酶破壁：称取1.0g湿菌体泥加入50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）定容至原发酵液体积制成菌悬液，加入800μL溶菌酶溶液，37℃振荡破壁30 min，将破壁后的菌悬液于4℃、12 000 r/min离心15 min去沉淀，收集上清液即为粗酶液，用于酶活性定性定量分析。

1.3.3TreS途径海藻糖合酶定性分析

取粗酶液加入同体积的10%麦芽糖溶液混合，37℃、160 r/min摇床振荡培养15 h酶解试验，沸水浴10 min灭酶终止反应，冷却后于4℃、12 000 r/min离心15 min去沉淀，取上清液利用硅胶板GF254薄层层析法对上清液中的糖分进行定性分析，点样量为1 μL。展开剂为正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶1（V/V），显色剂为浓硫酸∶甲醇=20∶80（V/V）。

1.3.4海藻糖合酶TreS途径的验证

取粗酶液分别加入同体积的5%麦芽糖溶液、5%葡萄糖溶液、ddH2O混合，37℃、160 r/min摇床振荡培养15 h酶解试验，沸水浴10 min灭酶终止反应，冷却后于4℃、12000r/min离心15min去沉淀，取上清液利用硅胶板GF254薄层层析法对上清液中的糖分进行定性分析验证该菌株海藻糖合成途径，点样量为1 μL。

1.3.5TreS途径海藻糖合酶定量分析

TreS途径海藻糖合酶酶活性分析参考文献［17］。取1mL粗酶液，与1 mL底物（10%麦芽糖溶液）混合后，在60℃水浴保温1 h，沸水浴10 min灭酶终止反应，调pH4.6后加入1 mL的糖化酶液，60℃保温1 h，沸水浴10 min灭酶活，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，稀释定容后，取稀释液1 mL与2 mL DNS，沸水浴10 min，冷却后于波长540 nm处比色。空白对照：1 mL底物（10%麦芽糖溶液）在60℃水浴保温1 h后，补加入1 mL粗酶液混匀，沸水浴10 min灭酶终止反应，其他操作同上。

海藻糖合酶酶活力定义：在60℃、pH7.0反应条件下，以10%麦芽糖为底物，每1 h产生1 mg海藻糖为1个酶活力单位（U/L）。

1.3.6菌株的鉴定［18-20］

形态学观察及生理生化特征分析：将筛选出的菌株接种到LB培养基平板上培养，观察其菌落生长特征：形状大小、边缘、隆起形状、透明度、色泽等，并作记录；革兰氏染色后，显微镜进行观察。

分子生物学鉴定：16S rDNA的扩增及测序，细菌DNA的提取按试剂盒说明书操作流程提取。PCR扩增采用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

PCR扩增体系25μL：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，2×EsTaqMasterMix（Dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，提取模板DNA 1.0 μL。

PCR反应条件：95℃预变性10 min，94℃变性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析检测验证后，序列测定送北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将测序结果序列提交Genbank数据库进行BLAST同源性序列比对相似性分析，并用MEGA 6.0软件构建16S rDNA基因的系统发育树。

1.3.7菌株产海藻糖合酶酶学性质研究

粗酶液12 000 r/min离心15 min去沉淀，上清液经60%（NH4）2SO4沉淀，透析脱盐后进行进行酶学性质的研究。

最适反应温度：将酶液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下，与底物10%麦芽糖进行酶促反应，酶转化结束后测定海藻糖合酶相对酶活力（均以同组中最高酶活力为100%），确定该菌株产海藻糖合酶最适反应温度。

热稳定性：将酶液分别在60℃保温0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min后，测定剩余海藻糖合酶相对酶活力，考察该菌株产海藻糖合酶的热稳定性。

最适作用pH：将酶液分别置于pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0缓冲溶液中，测定海藻糖合酶相对酶活力，确定该菌株产海藻糖合酶最适作用pH。

pH稳定性：将酶液分别与pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲溶液混合，于60℃保温30 min，测定相对酶活力，考察酶在不同pH条件下的稳定性。

1.3.8培养基优化正交试验

根据初始发酵培养基设计产酶发酵培养基优化正交试验。选择麦芽糖、蛋白胨、牛肉膏、无机盐（K2HPO4+ NaH2PO4+MgSO4·7H2O，质量比为1∶1∶1）为4种因素，每个因素设计3个水平，设计正交试验，培养基装液量60mL/250mL，37℃、160 r/min摇床振荡培养48 h，分析优化出菌株较佳的培养基配方。正交试验因素与水平见表1。

表1　发酵培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation medium formula optimization　g/L

2　结果与分析

2.1菌株的分离、筛选及产酶试验

通过富集培养、稀释平板法，经过45℃恒温培养的菌种筛选培养基平板上分离，交叉划线法进一步纯化筛选出17株菌株，将17株菌株分别接种于产酶培养基摇床发酵培养，发酵培养液高速离心收集菌体，振荡洗涤，溶菌酶破壁，离心获得粗酶液，粗酶液于麦芽糖酶解反应液，离心上清酶反应液利用硅胶板GF254薄层层析法对菌株酶反应液中的糖份进行定性分析，发现有4株菌株产生海藻糖痕迹，分别编号为T1、T2、T3、T4，由4株菌株的薄层层析结果可知，4株菌株的酶反应液中均含有海藻糖和麦芽糖，均能够产生海藻糖，菌株细胞内产海藻糖合酶。对其进行定量分析，结果见表2。

表2　菌株产海藻糖合酶定量分析结果Table 2 Quantitative analysis results of strains producing trehalose synthase

由表2可知，菌株T2检测出的海藻糖合酶酶活性较其他3株菌株的高，达到了120.0 U/g。故选择菌株T2为进行下一步研究的出发菌株，对其代谢途径、生物学特征及发酵产酶特性进行了研究。

2.2菌株T2海藻糖合酶TreS途径的验证

取菌株T2发酵产粗酶液分别加入同体积的5%麦芽糖溶液、5%葡萄糖溶液、ddH2O混合进行酶解试验，利用硅胶板GF254薄层层析法对菌株酶反应液中的糖份进行定性分析，结果表明，在以5%葡萄糖溶液、ddH2O为底物的酶解反应体系中，在硅胶板GF254薄层层析中均没有发现海藻糖的存在，在以5%麦芽糖溶液为底物的酶解反应体系中有海藻糖的生成，可以初步确定菌株T2以麦芽糖为底物合成海藻糖的途径是通过海藻糖合酶TreS途径酶解完成的。

2.3菌株T2的生物学鉴定

2.3.1菌株T2的形态特征

菌株T2接种到LB培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养24 h后，菌落形状不规则，直径2～3 mm，白色，凸起，不透明，黏稠有光泽，易于挑起，革兰氏染色为阳性，有芽孢产生，显微观察结果见图1。由图1可知，菌体呈杆状，长2.0～5.0 μm，宽0.8～1.1 μm。

图1　菌株T2显微照片（×1000）Fig.1 Photomicrograph of strain T2（×1000）

2.3.2菌株T2生理生化特征

菌株T2生理生化特征见表3。

表3　菌株T2生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain T2

由表3可知，根据菌株的生理生化特征，可以初步判断该菌株T2为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。

2.3.3菌株T2分子生物学特征

以提取的菌株T2的DNA为模板，采用细菌提取扩增通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3进行PCR扩增，菌株T2的16S rDNA的PCR扩增结果见图2。

图2　PCR扩增的16S rDNA电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA of strain T2

从图2可以看出，经PCR扩增后，根据与北京康为世纪生物科技有限公司DNA Marker DL2000对照，得到了一个片段长度为1 409 bp的DNA片段。将测序结果基因序列提交到GenBank核酸序列数据库中与已有的相关同源序列BLAST比对分析。并在16S rDNA基因序列同源性基础上构建系统发育树，菌株T2的系统发育树见图3。

图3　菌株T2的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain T2

通过以上对菌株T2的形态特征、主要生理生化特征、16S rDNA的基因序列分析及系统发育树分析，16S rDNA基因于菌株Bacillus aerophilus28K（T）相似性达到100%，可以初步认定该菌株T2为芽孢杆菌属的嗜气杆菌（Bacillus aerophilus）。

2.4菌株T2产海藻糖合酶酶学性质研究

2.4.1最适作用温度

图4　温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on trehalose synthase activity

由图4可知，菌株T2产海藻糖合酶最适作用温度为60℃。

2.4.2海藻糖合酶的热稳定性

图5　酶的热稳定性Fig.5 Thermal stability of trehalose synthase

由图5可知，60℃条件下，菌株T2产海藻糖合酶保温100 min剩余酶活性80.7%，说明酶热稳定性良好。

2.4.3最适作用pH

图6　pH值对酶活力的影响Fig.6 Effect of pH on trehalose synthase activity

由图6可知，pH值为7时，菌株T2产海藻糖合酶酶活力达到最大值，因此，菌株T2产海藻合酶的最适pH值为7。

2.4.4pH稳定性

图7　酶的pH稳定性Fig.7 pH stability trehalose synthase

由图7可知，菌株T2产海藻糖合酶在pH 6.0～7.5范围内保温30 min，剩余酶活力均＞63%，说明酶活在pH 6.0～7.5范围较为稳定。

2.5菌株T2产海藻糖合酶培养基优化试验

表4　发酵培养基配方优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation medium formula optimization

由表4可知，对菌株T2产海藻糖合酶发酵培养基中的影响因素为C＞A＞B＞D。其适宜的培养基配方为C3A2B3D2，即牛肉膏3.0 g/L，麦芽糖20.0 g/L，蛋白胨7.5 g/L，无机盐（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此优化的培养基下，菌株T2细胞内产海藻糖合酶酶活力达到310.6 U/L。

3　结论

本研究从河南鲁山上汤温泉水样及其附近土壤中，经筛选培养基高温高盐培养，分离筛选得到一株产海藻糖的菌株T2，通过对菌株T2的形态特征、主要生理生化特征、16SrDNA的基因序列分析及系统发育树分析，初步认定该菌株T2为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。经过生物合成途径初步验证，该菌株含有海藻糖合酶以TreS途径将麦芽糖转化为海藻糖。对该菌株发酵产海藻糖合酶酶学性质就行了研究，其最适作用温度为60℃，在60℃条件下，菌株T2产海藻糖合酶保温100 min仍能保持酶活性80.7%；pH 7.0时，菌株T2产海藻糖合酶酶活力达到最大值，在pH 6.0～7.5范围内保温30 min，剩余酶活力在63%以上。对该菌株发酵产海藻糖合酶培养基进行了优化研究，其适宜的培养基配方为C3A2B3D2，即牛肉膏3.0 g/L，麦芽糖20.0 g/L，蛋白胨7.5g/L，无机盐（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此优化的培养基下，菌株T2产海藻糖合酶酶活力达到310.6 U/L。

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Screening and identification of a trehalose-producing strain and its enzyme-producing characteristics

LIU Dehai1，QUAN Shujing2，XIE Fuhong2，MA Huan2，GONG Tao1，JIA Bin2，CHEN Guocan1
（1.Institute of Biology Co.，Ltd.，Henan Academy of Science，Zhengzhou 450008，China；2.Henan Engineering Research Center of Industrial Enzymes，Zhengzhou 450008，China）

Through the method of high NaCl concentration cultivation with maltose as single carbon source，a strain T2 producing trehalose synthase was screened from hot springs water and nearby soil.By primarily biosynthetic validation，the results showed that strain T2 produced trehalose synthase，and it could convert maltose into trehalose by trehalose synthase（TreS）path.The cells were gram-positive，rods，endospores，and strain T2 was primary identified asBacillussp.by biological identification.The enzymatic characteristics of trehalose synthase were studied，it showed that the optimum reaction temperature and pH were 60℃and 7.0，respectively.After incubation at 60℃for 100 min，it remained 80.7%of its activity.The enzyme was stable in the range of pH 6.0-7.5.Compositions of medium was optimized by L9（34）orthogonal experiments，and the optimum medium compositions were beef extract 3.0 g/L，maltose 20.0 g/L，peptone 7.5 g/L，inorganic salt（K2HPO4+NaH2PO4+MgSO4·7H2O）3.0 g/L.The trehalose synthase activity of the strain T2 was up to 310.6 U/L under the optimized conditions.

trehalose；trehalose synthase；trehalose synthase path；screen；identification

TQ920.1

0254-5071（2016）09-0095-06doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.022

2016-06-08

2015年河南省科技创新杰出人才项目（154200510025）

刘德海（1970-），男，研究员，本科，主要从事酶工程研究工作。