产细菌素戊糖乳杆菌B8发酵动力学模型的建立

赖　文，张全林，任红宇

（阆中市农牧业局，四川 阆中 637400）

产细菌素戊糖乳杆菌B8发酵动力学模型的建立

赖文，张全林，任红宇

（阆中市农牧业局，四川 阆中 637400）

从四川香肠中选育出一株具有产细菌素能力的戊糖乳杆菌B8，在10 L发酵罐内对其进行分批发酵动力学研究，建立菌体生长、产物合成、底物消耗及pH随时间变化的动力学模型，确定模型参数，得到其菌体生长动力学模型）、细菌素生产动力学模型葡萄糖消耗动力学模型pH值变化的数学模型y=结果表明，模型预测值与实验值吻合较好，为工业放大生产细菌素提供了理论依据和方法。

戊糖乳杆菌；细菌素；动力学模型

乳酸菌细菌素是在乳酸菌代谢过程中由核糖体合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽［1-2］，已在水产养殖、蚕业、动物生产［3-7］等方面有重要应用。生物培养的生物化学过程非常复杂，包括了各种反应与物质交换，因此，建立动力学模型是为了尽可能简单的描述最基本的反应特征［8-10］。本试验对筛选于四川发酵香肠中具有产生细菌素能力的戊糖乳杆菌B8进行分批发酵动力学模型研究，旨在为进一步放大试验和工业大规模生产提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）B8：分离于四川香肠；指示菌：藤黄微球菌（Micrococcus luteus）10209、铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853。

1.1.2试剂

Nisin（106IU/g）：浙江银象生物技术有限公司；葡萄糖、蒽酮、硫酸铵、浓硫酸等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3培养基

种子培养基和发酵培养基均采用MRS液体培养基。

MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5 g、柠檬酸二胺2 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠2 g、硫酸锰0.25 g、硫酸镁0.58 g、水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121℃灭菌15 min。

1.2仪器与设备

RZ-10 L发酵罐：南京润泽生物工程设备有限公司；SW-CJ-D洁净工作台：苏州净化设备有限公司；YX-280B灭菌锅：武汉金志飞净化设备有限公司；PHS-3C pH计：上海精科仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1发酵方法

将戊糖乳杆菌B8活化，接入种子培养基，逐步扩大培养，以3%的接种量接种于装有7 L发酵培养基的发酵罐中，培养条件为30℃、起始pH 6.0、100 r/min搅拌。分别于0、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、28 h、32 h、36 h 9个点取样，每次取样50 mL，置于4℃冰箱中保存，用于分批发酵各项指标测定。

1.3.2分析方法

生物量测定：取发酵液40 mL，于4℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清液。沉淀用10 mL无菌水洗涤2次，收集菌体于80～90℃干燥至恒质量，称量。

葡萄糖测定：蒽酮-硫酸比色法［11-12］。

pH的测定：pH计测定。

细菌素产量的测定：发酵上清液用硫酸铵（70%饱和度）沉淀，缓慢搅拌1 h，4℃放置12 h，10 000 r/min离心30 min，收集沉淀。加入0.02 mol/L盐酸0.5 mL使之溶解，得到粗提液。采用牛津杯双层琼脂法，向含指示菌平板（107CFU/mL）琼脂孔中加入100 μL粗提液和对照液。4℃扩散1 h，37℃恒温培养16～18 h，测量抑菌圈直径。

0.02mol/LHCl配制效价100～2000IU/mL（以500 IU/mL递增）的Nisin溶液，以藤黄微球菌为指示菌，检测活性。以效价对数值为横坐标（X）、抑菌圈直径为纵坐标（Y），绘制Nisin效价标准曲线。标准曲线方程为Y=4.432 6X+ 3.980 7，相关系数R2=0.997 8。取样品液100 μL加入铜绿假单杆菌检测平板中，3次重复，样品抑菌圈直径平均值计算样品效价。

1.3.3数据处理方法用Origin8.0软件处理实验数据和模型，拟合模型参数。

2　结果与分析

2.1戊糖乳杆菌B8的分批发酵过程

图1　分批发酵曲线Fig.1 Batch fementation curve

戊糖乳杆菌B8在发酵过程中生物量（X），细菌素产量（P）、底物消耗（S）和pH值（y）随发酵时间（t）变化情况见图1。发酵过程中，戊糖乳杆菌B8适应期较短，可忽略。在对数生长期内，菌体快速生长伴随着葡萄糖快速消耗、细菌素生成和pH的快速下降。生物量在发酵24 h后变化减缓，葡萄糖消耗亦减慢。从发酵过程看，戊糖乳杆菌B8发酵产生细菌素的过程符合微生物次级代谢产物合成规律。

2.2发酵动力学模型的建立

2.2.1菌体生长动力学模型

Logistic方程是一个典型的S型曲线，能反映分批发酵过程中菌体浓度增加对自身生长的抑制作用，较好地拟合发酵过程的菌体生长规律。采用此方程作为戊糖乳杆菌B8菌体生长动力学模型。

式中：X为发酵过程中菌体含量，g/L；μm为最大比生长速率，h；Xm为发酵过程中最大菌体质量浓度，g/L；t为发酵时间，h。

2.2.2产物生成动力学模型

产物生成动力学模型发酵产物形成非常复杂，GADEN E L Jr.［13］根据分批发酵产物生成和细胞生长之间关系将产物生成动力学模型分为3种类型：Ⅰ产物形成与细胞生长相耦联；Ⅱ产物形成与细胞生长部分耦联；Ⅲ产物形成与细胞生长没有联系。Luedeking—Piret方程如下［14］：

式中：P为细菌素效价（IU/mL）；α为与菌体生长相关联产物生成常数；β为与菌体量相关联产物生成常数。当α≠0、β=0时，表示I类发酵；α≠0、β≠0时，表示Ⅱ类发酵；α=0、β≠0时，表示Ⅲ类发酵。

2.2.3基质消耗动力学模型

发酵过程中基质（葡萄糖）消耗主要用于细胞生长，代谢产物积累和细胞维持。底物消耗动力学模型底物消耗模型有基于物料衡算的理论模型：

式中：S为葡萄糖质量浓度，g/L；ms为维持系数，g/（g·h）；Yx/s为菌体得率系数，g/g；Yp/s为对底物的产物得率系数，g/g。

2.2.4pH值变化数学模型

戊糖乳杆菌B8发酵过程中发酵液pH值随时间改变，主要因为发酵产生大量乳酸。在乳酸发酵动力学模型中，将乳酸产量用产物形成模型来分析［15］，但乳酸含量增加不是影响发酵液pH改变的唯一因素。戊糖乳杆菌B8发酵过程中pH值变化成典型反S型趋势，选用非线性拟合中的“Growth/Sigmoidal”中的函数进行拟合分析，并做模型比较，确定最优模型。

2.3动力学模型求解拟合

2.3.1菌体生长动力学模型的求解

对式（1）进行积分可得

用Origin 8.0按式（4）非线性曲线拟合，得到菌体浓度X随时间变化的函数为：

根据式（5）计算出最大菌体含量Xm=1.908 g/L，菌体初始含量X0=0.063 74 g/L，最大比生长速率μm=0.566 9 h-1。戊糖乳杆菌B8菌体生长动力学模型见式（6），曲线拟合度为0.995 2：

该方程与实验所得数据能较好的拟合，结果如图2所示，该菌体生长模型能较好地描述发酵过程中的菌体生长情况。

图2　菌体浓度随时间变化曲线Fig.2 Changes of bacteria concentration with time

2.3.2产物生产动力学模型求解

将式（1）代入式（2）并积分：

将μm=0.566 9，X0=0.063 74 g/L，Xm=1.908 g/L，代入产物生成动力学模型，整理成：

用Origin 8.0对发酵过程中细菌素合成数据处理，可得α=75.25，β=122.94，因此细菌素生成动力学表达式为式（9）：

该方程与实验所得数据能较好的拟合（如图3），曲线拟合度为0.991 4，该产物形成模型能较好地描述发酵过程中的细菌素的形成情况，预测生产过程中细菌素产量。

图3　细菌素产量随时间变化曲线Fig.3 Changes of bacteriocin accumulation with time

2.3.3底物消耗动力学模型的求解

为简化模型，菌体呼吸等维持代谢消耗归结在长菌消耗之内，因此可以采用Luedeking—Piret—Like方程来描述底物的消耗情况：

式中：S为葡萄糖的质量浓度，g/L；k1为与菌体生长相关联的底物消耗常数；k2为与菌体量相关联的底物消耗常数。

将式（1）和式（2）代入式（10）积分得：

S0为葡萄糖的初始质量浓度（g/L），用Origin8.0软件按式（11）进行非线性曲线拟合，可求得S0=18.79，k1=5.843，k2=0.799 8，获得底物消耗动力学方程为：

该方程与实验数据能够较好的拟合（图4），曲线拟合度为0.998 7。该基质消耗模型能很好地描述发酵过程中的基质葡萄糖的消耗情况，可用于预测生产过程中葡萄糖的需求量。

图4　葡萄糖消耗量随时间变化曲线Fig.4 Changes of glucose consumption with time

2.3.4发酵pH值变化数学模型

由图1可知，发酵过程中pH值变化成典型反S型趋势，选用非线性拟合中的“Growth/Sigmoidal”中的函数进行拟合分析，得出两个拟合度较高的方程如下：

用Origin 8.0对Logistic方程及Hill1方程做比较，结果见图5及表1。

图5　pH值随时间变化曲线Fig.5 Changes of pH value with time

表1　模型比较Table 1 Comparison of models

由此可知，Logistic方程AIC值低于Hill1方程，准确性为Hill1方程的1.065 89倍，即以Logistic方程建立的pH变化模型较优。最终获得pH随时间变化的方程为：

3　结论

采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程，结合戊糖乳酸杆菌B8发酵特征分析，建立了戊糖乳杆菌发酵过程中菌体生长、产物形成、基质消耗的动力学模型及pH值变化的数学模型。三个动力学模型的拟合度都较高，因此可以用来描述戊糖乳杆菌B8在发酵生产细菌素的发酵过程。pH值变化的数学模型拟合度高，可用作了解发酵液pH值变化，并在进一步的试验中了解该模型适用性和建立参数与发酵过程的关系。对于优化发酵工艺，进一步放大具有重要指导作用。

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Establishment of fermentation kinetic models for bacteriocin-producingLactobacillus pentosusB8

LAI Wen，ZHANG Quanlin，REN Hongyu
（Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Langzhong，Langzhong 637400，China）

Lactobacillus pentosusB8 with bacteriocin production was screened from Sichuan sausage，and batch fermentation kinetic study was investigated in 10 L fermentor.The kinetic models of cell growth，bacteriocin production，substrate consumption and pH with time were established， model parameters were determined.The cell growth model was），the bacteriocin production model was 122.94X，the substrate consumption model was，and pH model wasy=+5.992 8.The results obtained from model were in agreement with experiments data，indicating that the models had good applicability.

Lactobacillus pentosus；bacteriocin；kinetic model

Q936

0254-5071（2016）09-0086-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.020

2016-04-25

赖文（1985-），女，农艺师，硕士，研究方向为农产品质量安全。