优化西瓜汁培养基提高细菌纤维素产量和性能

姜晓琳，卢红梅，陈　莉

（1.贵州理工学院 轻工工程学院，贵州 贵阳 550003；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

优化西瓜汁培养基提高细菌纤维素产量和性能

姜晓琳1，卢红梅2，陈莉2

（1.贵州理工学院 轻工工程学院，贵州 贵阳 550003；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

以木醋杆菌（Acetobacter xylinum）为发酵菌种，通过Plackett-Burman试验设计进行主效应因子的筛选，对西瓜汁培养基中无水乙醇和FeSO4的添加量进行优化，以细菌纤维产量为评价指标，获得最优的培养基为酵母膏12.5 g/L，蛋白胨10.0 g/L，磷酸二氢钾6.5 g/L，硫酸镁3.1 g/L，硫酸亚铁0.2 g/L，柠檬酸0.3 g/L，用西瓜汁培养基基料配制成1 000 mL，灭菌冷却后无菌地加入无水乙醇36 mL/L。在此最优条件下，细菌纤维素产量为6.39 g/L，分别是西瓜汁培养基基料及基础培养基发酵细菌纤维素产量的6.82倍、1.33倍。优化后的西瓜汁培养基发酵产细菌纤维素，其含水率、复水率、结晶度、热稳定性较优，分别比基础培养基提高了0.59%、3.27%、5.04%和6.03%。

西瓜汁；细菌纤维素；木醋杆菌；Plackett-Burman设计；培养基

椰子水是最早用于生产细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）的原料，近年细菌纤维素凭借其优良的特性被广泛运用于医疗［1-6］、食品［7］、环保［8-11］、造纸［12-13］等诸多领域，细菌纤维素需要量巨大，有限的椰子水资源早已供不应求，且以椰子水为主要原料具有地域性和季节性，无法满足市场扩增的需要。寻找替代的原料成为研究的一大热点。西瓜是夏季最主要的水果之一，深受大家喜爱，但由于其产量大、产期集中、不耐储存，而使售价偏低，有些地方甚至出现成片的西瓜烂在地里。西瓜含有丰富的糖类、蛋白质以及各种维生素和矿物质，这些都是木醋杆菌（Acetobacter xylinum）生长、分泌细菌纤维素必不可少的营养成分。将西瓜汁用于细菌纤维素的发酵，可以提高农产品的附加值，增加瓜农的经济收入。另据报道［14-16］，不同培养基发酵的细菌纤维素在性能（含水率、复水率、结晶度、热稳定性等）上会有不同。生产细菌纤维素的原料非常多，其成本也相差很大。如果能够了解不同原料对细菌纤维素结构、性能的影响，就可以按所需细菌纤维素的性能而挑选生产原料，这样，不同原料生产的具有性能差别的细菌纤维素可以一一对应于其在各个领域的应用，会大大降低生产成本。本研究对西瓜汁培养基与基础培养基发酵的细菌纤维素在产量和产品性能方面进行比较，以期找到一种提高细菌纤维素产量、性能并降低发酵成本的方法。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种及材料

木醋杆菌（Acetobacter xylinum）：贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏；西瓜汁：市售西瓜榨汁于冰箱中冻藏。

1.1.2化学试剂

α-1，4-葡萄糖水解酶（酶活力为50 000 U/g）：上海佳和生物科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市登科化学试剂有限公司；氢氧化钠、氢氧化钾（均为分析纯）：重庆茂业化学试剂有限公司；乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；苯酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；硫酸、乙酸（均为分析纯）：重庆川江化学试剂厂。

1.1.3培养基

斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5 g/L，柠檬酸1 g/L，磷酸氢二钠2 g/L，琼脂20 g/L，用蒸馏水配成1 000 mL。121℃条件下灭菌20 min。

木醋杆菌液体种子培养基：蔗糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁1 g/L，121℃条件下灭菌20 min冷却后加入无水乙醇，使培养基中乙醇含量为30 mL/L。

基础培养基：蔗糖50g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨8.0 g/L，KH2PO44.3 g/L，MgSO42.5 g/L，121℃条件下灭菌20 min冷却后加入无水乙醇［16］，使培养基中乙醇含量为30 mL/L。

1.2仪器与设备

UV-2550紫外-可见光分光光度计：日本岛津公司；SMART APEXⅡ单晶衍射仪：德国Bruker公司；STA 449C TG-MS热分析仪：德国NETZSCH公司。

1.3方法

1.3.1总糖含量的测定

葡萄糖标准曲线的绘制：取9支25 mL比色管，分别加入1g/L的葡萄糖标准溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，再分别加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液，置于沸水浴中进行显色2 min，用流水迅速冷却到室温，用蒸馏水定容到25 mL，摇匀，试剂空白调零，在波长540 nm处测定吸光度值，以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，得到标准曲线回归方程为A=0.914 50C-0.004 93，相关系数R2为0.999 63。

样品处理：发酵液及所得细菌纤维素膜经4 000 r/min离心20 min，取5 mL上清液加到250 mL容量瓶中，加入30 mL蒸馏水，5 mL 6 mol/L的HCl，在70℃条件下水浴15 min，冷却到室温，调pH值为7～8，并定容至250 mL，作为样品水解液备用。

样品测定：吸取样品水解液1.0 mL，按照葡萄糖标准曲线绘制的操作测定样品吸光度值，将吸光度值代入标准曲线回归方程计算水解液中葡萄糖含量，发酵液总糖含量计算公式如下：

总糖含量（mg/mL）=K×C

式中：K为样液的稀释倍数，50倍；C为样品测定的吸光度值代入回归方程计算的水解液中葡萄糖含量，mg/mL。

1.3.2西瓜汁培养基基料制备

将西瓜榨汁纱布过滤，西瓜汁经DNS法测总糖含量为70.65 g/L，取西瓜汁708 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，则所得西瓜汁溶液总糖含量为50 g/L，以此作为西瓜汁培养基基料。

1.3.3培养方法

装液量为50 mL/250 mL发酵培养基，灭菌冷却后无菌的加入无水乙醇，使培养基中乙醇含量为30 mL/L，摇匀，接入8%（V/V）木醋杆菌种子液，在30℃恒温培养箱中静置培养，前期实验测得2～3 d时，细菌纤维素产量增加迅速，到7～8 d时由于发酵液中残糖的减少，细菌纤维素产量增加缓慢或不再增加，所以发酵时间设为8 d。

1.3.4细菌纤维素产量测定

细菌纤维素纯化：从锥形瓶中取出细菌纤维素膜，用蒸馏水冲洗膜表面的杂质，将膜放在80℃、0.1 mol/L的NaOH溶液中2 h，以去除残留在膜表面的菌体蛋白及发酵液残留物，至膜由黄色变为无色透明状，冷却至室温，取出膜，置于0.5%（V/V）乙酸溶液中30 min中和，中和后用蒸馏水充分洗涤膜，洗涤后膜呈中性。

细菌纤维素干燥：将纯化后的细菌纤维素湿膜贴至塑料板上，在80℃烘箱中干燥至恒质量。细菌纤维素产量的计算公式如下：

1.3.5Plackett-Burman试验设计

根据前期的试验，选取酵母膏、蛋白胨、无水乙醇、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸添加量为Plackett-Burman（PB）试验影响因素，以细菌纤维素产量（Y）为评价指标，设计Plackett-Burman试验，利用Design Expert 7.0软件进行模型建立及数据分析，PB试验因素与水平见表1。

表1　Plackett-Burman试验设计因素与水平（n=12）Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design（n=12）

1.3.6西瓜汁培养基优化

根据PB试验挑选出最显著的因素，其他因素对结果影响不大，固定其他因素的添加量为高水平和低水平添加量的平均值，考察显著因素不同水平添加量对细菌纤维素产量的影响，得出最优的培养基。

1.3.7细菌纤维素性能分析

（1）持水性分析

将纯化后的细菌纤维素膜经4 000 r/min离心20 min，得到此膜定义为湿膜；将80℃条件下烘干至恒质量的膜定义为干膜；在室温下，用蒸馏水中浸泡干膜48 h，并用滤纸除去表面水分，得到的膜定义为复水膜。纤维素膜的持水性以含水率和复水率值来表示［17］，其含水率和复水率计算公式如下：

式中：Mw为湿膜的质量，g/L；Md为干膜的质量，g/L；Mwr为

复水膜的质量，g/L。

（2）X-射线衍射

将干膜平铺于样品架上，使用单晶衍射仪对其进行X-射线衍射（x-ray diffraction，XRD）测试。测试条件为：铜靶，测试电流为40 mA，为测试电压45 kV，速率为5°/min，步宽为0.04°，2θ为5～90°大范围扫描。根据X-射线衍射参数，细菌纤维素的结晶度（Xc）的计算公式如下［17］：

式中：Xc为结晶度，%；I为衍射峰的衍射强度，CPS；Iam

为无定形区衍射强度，CPS。

（3）热重分析

称取适量干膜，利用热分析仪进行热重分析测试细菌纤维素的热稳定性。测试条件为：N2气氛，从20℃升温至800℃（升温速率为10℃/min）［18］，观察样品质量随温度增加的变化情况，得到微分热重分析（differential thermogravimetric analysis，DTG）曲线、热重（thermogravimetric analysis，TG）曲线和差热分析（differential thermal analysis，DTA）曲线。

2　结果与分析

2.1西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素

未优化培养基时，利用西瓜汁培养基基料培养木醋杆菌生产细菌纤维素，培养时间为8 d，产量为0.937 g/L，利用基础培养基时细菌纤维素产量为4.80 g/L。西瓜汁基料发酵的细菌纤维素产量远远小于基础培养基的产量。由于西瓜汁培养基基料的总糖含量与基础培养基都为50 g/L，说明导致西瓜汁基料培养细菌纤维素产量低的原因是除糖类外的其他营养成分不足，用西瓜汁培养细菌纤维素应该进行培养基优化。

2.2西瓜汁培养基优化

2.2.1西瓜汁培养基主要因素的筛选

以酵母膏、蛋白胨、无水乙醇、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，以细菌纤维素产量（Y）为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，Plackett-Burman试验设计与结果见表2。利用Design Expert 7.0对表2数据进行效应评价分析，结果见表3。

表2　Plackett-Burman试验设计与结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3　Plackett-Burman试验主效应分析Table 3 Analysis of main effect of the Plackett-Burman experiments

由表3可知，FeSO4（P=0.031 9＜0.05）和无水乙醇（P= 0.000 4＜0.01）的效应显著，可以进一步优化。其他因素对结果影响不大（P＞0.05），在后续研究中作为条件因素。

2.2.2FeSO4、无水乙醇添加量的确定

由上述PB试验可知，FeSO4、无水乙醇为对结果影响最显著的因素，其他因素对结果影响不大，固定其他因素的添加量为高水平和低水平添加量的平均值，即酵母膏为12.5 g/L、蛋白胨为10.0 g/L、KH2PO4为6.5 g/L、MgSO4为3.1 g/L、柠檬酸为0.3 g/L，考察0.1～0.3 g/L FeSO4和2.8%～4.4%（V/V）无水乙醇添加量对细菌纤维素产量的影响，结果见图1。

图1　FeSO4和无水乙醇交互作用对细菌纤维素产量的影响Fig.1 Effects of interaction between FeSO4and ethanol on bacterial cellulose yield

由图1可知，随着FeSO4添加量的增加，细菌纤维素的产量呈先上升后下降的趋势，而随着无水乙醇添加量的增加，产量也呈现先上升后下降的趋势。在FeSO4添加量为0.3 g/L、无水乙醇添加量为36 mL/L时，细菌纤维素最大产量为6.39g/L，是未优化前的西瓜汁培养基基料培养木醋杆菌产细菌纤维素（0.937 g/L）的6.82倍。

2.3细菌纤维素性能分析

2.3.1持水性分析

细菌纤维素的持水性常以含水率和复水率值来表示［19］，各纤维素膜的含水率和复水率结果如表4所示。

表4　各培养基细菌纤维素膜的持水性和复水性Table 4 Water-holding capacity and rehydration properties of bacterial celluloses produced by each medium

由表4可知，与基础培养基相比，西瓜汁优化培养基培养的细菌纤维素含水率和复水率略高于基础培养基培养的细菌纤维素，说明西瓜汁优化培养基培养的细菌纤维素持水性较好。

2.3.2X-射线衍射

采用X-射线衍射法来测定细菌纤维素的结晶度。各培养基生产的细菌纤维素的X-射线衍射图谱如图2所示。

由图2可知，采用两种培养基生产的细菌纤维素X-射线衍射谱图形态大致相同，分别在大致相同的位置14.8°、17.1°和22.9°附近含有主要的衍射峰，说明合成物质为同一种物质，14.8°衍射峰对应细菌纤维素晶体的〈101〉晶面；17.1°衍射峰对应〈110〉晶面；22.9°衍射峰对应〈002〉晶面，是纤维素Ⅰ的特征峰，说明细菌纤维素样品的晶体结构是纤维素Ⅰ，这与马霞报道的结果一致［20］。根据X-射线衍射实验数据，分别根据公式计算各培养基细菌纤维素的结晶度，结果见表5，其中Ⅰ为衍射峰的衍射强度，CPS；Ⅰam为无定形区衍射强度，CPS。

图2　基础培养基（A）及西瓜汁培养基（B）产细菌纤维素的X-射线衍射谱图Fig.2 X-ray diffraction spectrogram of bacterial celluloses produced by basic medium（A）and watermelon juice medium（B）

表5　各培养基细菌纤维素结晶度Table 5 Crystallinity of bacterial cellulose produced by each medium

由表5可知，与基础培养基相比，西瓜汁优化培养基发酵的细菌纤维素结晶度81.31%，比基础培养基的细菌纤维素结晶度76.27%提高了6.61%。

2.3.3热重分析

细菌纤维素的热稳定性决定了其作为材料应用的适合温度，对西瓜汁培养基、基础培养基培养的细菌纤维素进行热重分析，其热重分析-差热分析法（thermogravimetric analysis-differential thermal analysis，TG-DTA）的图谱见图3所示。

由图3可知，各培养基产细菌纤维素TG曲线分为三个阶段：0～170℃内样品质量轻度耗损阶段，170～550℃内样品质量快速耗损阶段，550～800℃内样品质量轻微耗损阶段。170～550℃阶段，最大失重速率处温度分别为333.5℃、353.6℃，此阶段质量降低速度快，持续时间长，为细菌纤维素的降解阶段，对于材料热稳定性采用最大失重速率法来衡量，最大失重速率处温度越高，细菌纤维素的热稳定性越好，则热稳定性西瓜汁培养基产细菌纤维素的热稳定性优于基础培养基，这与GEORGE J等［21］报道的细菌纤维素分解温度为350℃的结果基本一致。

图3　基础培养基（A）及西瓜汁培养基（B）产细菌纤维素的TG-DTA图谱Fig.3 TG-DTA spectrum of bacterial cellulose produced by basic medium（A）and watermelon juice medium（B）

3　结论

优化后的西瓜汁培养基为酵母膏12.5 g/L，蛋白胨10.0 g/L，磷酸二氢钾6.5 g/L，硫酸镁3.1 g/L，硫酸亚铁0.2 g/L，柠檬酸0.3 g/L，用西瓜汁培养基基料配制成1 000 mL，灭菌冷却后无菌地加入无水乙醇36 mL/L。在此最佳条件下，细菌纤维素产量为6.39g/L，分别是西瓜汁培养基基料及基础培养基产细菌纤维素产量的6.82倍、1.33倍。

优化后的西瓜汁培养基发酵产细菌纤维素，其含水率、复水率、结晶度、热稳定性较优，分别比基础培养基提高了0.59%、3.27%、5.04%和6.03%。和其他的原料相比，西瓜汁培养基发酵生产的细菌纤维素具有较高的持水性及热稳定性，可作为医用敷料。

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Optimization of watermelon juice medium for improving bacterial cellulose yield and properties

JIANG Xiaolin1，LU Hongmei2，CHEN Li2
（1.School of Light Industry Engineering，Guizhou Institute of Technology，Guiyang 550003，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

With Acetobacter xylinum as fermentation strain，by Plackett-Burman design，the main effect factors were screened and the ethanol and FeSO4addition in watermelon juice medium were optimized.With bacterial cellulose（BC）yield as evaluation indexes，the optimum medium was obtained as followed：yeast extract 12.5 g/L，peptone 10.0 g/L，KH2PO46.5 g/L，MgSO43.1 g/L，FeSO40.2 g/L，citric acid 0.3 g/L and watermelon juice 1 000 ml，after sterilization and cooling，adding ethanol 36 ml/L.Under the optimum condition，BC yield was 6.39 g/L，which was 6.82 and 1.33 times of watermelon juice medium base material and basic medium，the moisture content，rehydration rate，crystallinity and thermostability of bacterial cellulose fermented by watermelon juice medium optimized were increased by 0.59%，3.27%，5.04%and 6.03%of basic medium，respectively.

watermelon juice；bacterial cellulose；Acetobacter xylinum；Plackett-Burman design；medium

TQ35

0254-5071（2016）09-0081-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.019

2016-05-13

姜晓琳（1989-），女，硕士，研究方向为发酵工程。