同位素稀释—气相色谱—质谱法测定食用植物油中总氯丙醇脂肪酸酯

李珊 易青 苗虹 吴永宁

摘要建立了食用植物油中总氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）的同位素稀释气相色谱质谱（GCMS）检测方法。样品经甲醇钠甲醇溶液水解，硅藻土小柱净化，七氟丁酰咪唑（HFBI）衍生后，GCMS检测，同位素内标法定量。3MCPD酯、2MCPD酯、1，3DCP酯和2，3DCP酯在0.050～2.000 mg/L浓度范围内，均呈良好线性相关，相关系数（R）均大于0.9995。3MCPD酯、2MCPD酯、1，3DCP酯和2，3DCP酯的检出限分别为0.015， 0.015， 0.030和0.030 mg/kg，定量限分别为0.050， 0.050， 0.100和0.100 mg/kg。以空白特级初榨橄榄油为空白基质的加标回收实验的平均回收率为87.0%～110.5%，相对标准偏差（RSD）均小于10.1%。在74份食用植物油样品中，3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的检出率分别为94.6%， 63.5%和5.4%，未检出2，3DCP酯；3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的含量分别在未检出（ND）～10.646 mg/kg、ND～3.617 mg/kg和ND～0.089 mg/kg之间。本方法简便、准确、可靠，适用于食用植物油中总氯丙醇酯的测定。

关键词 食用植物油； 氯丙醇脂肪酸酯； 气相色谱质谱法； 同位素稀释技术

1引言

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）是存在于含油脂食品中的一类污染物，是脂肪酸与氯丙醇的结合产物，包括单氯取代的3氯1，2丙二醇脂肪酸酯（3MCPD酯）和2氯1，3丙二醇脂肪酸酯（2MCPD酯），以及双氯取代的1，3二氯2丙醇脂肪酸酯（1，3DCP酯）和2，3二氯1丙醇脂肪酸酯（2，3DCP酯）。已有动物体内实验证明，3MCPD酯在体内经肠脂肪酶水解后转化为3MCPD[1，2]。毒理学资料表明，3MCPD具有遗传毒性、肾脏毒性和神经毒性[3～5]；2MCPD的结构与3MCPD极其相似，其毒性以及可能引起的健康风险不容忽视；1，3DCP可导致小鼠肝脏和肾脏的损伤，2，3DCP对肾脏的损伤作用超过1，3DCP[6]。 Liu等[7]研究了3MCPD 棕榈酸单酯和双酯对瑞士小鼠的急性口服毒性以及对NRK52E 大鼠肾脏细胞的毒性，结果表明，3MCPD 棕榈酸单酯和3MCPD棕榈酸双酯均可引起大鼠肾小管坏死、蛋白質管型、生精小管的精子细胞减少等症状；3MCPD棕榈酸单酯可引起大鼠肾脏细胞的细胞毒性，而双酯则未发现引起细胞毒性的迹象，可见3MCPD 棕榈酸单酯毒性强于其双酯。

食品中氯丙醇酯的检测方法包括间接测定法[8～10]（即气相色谱质谱法（Gas chromatographymass spectrometry，GCMS））和直接测定法[11，12]（即液相色谱质谱法（Liquid chromatographymass spectrometry，LCMS））。GCMS方法应用较为普遍，文献报道的各种以GCMS测定氯丙醇酯的方法，绝大多数上是基于德国脂肪科会（DGF）的CVI 18（10）方法[13]，实验步骤（见图1，以3MCPD酯为例）主要包括样品水解、净化、衍生。在已报道的氯丙醇酯的测定方法中，主要是针对3MCPD酯的测定。鉴于其它氯丙醇及氯丙醇酯的毒性作用，需对氯丙醇酯总量进行测定。

氯丙醇酯主要是在食品加工过程中，尤其是在油脂精炼过程中形成的[14]，污染水平最高的是3MCPD酯[3]，其次是2MCPD酯。食用植物油是人类膳食的重要组成部分。食用植物油中氯丙醇酯污染水平较高[15，16]，由食用植物油引起的氯丙醇酯膳食暴露风险也随之增高，这使得氯丙醇酯成为近年来国际食品安全研究的重要热点问题。在各种氯丙醇酯气相色谱质谱检测的基础上，本研究建立了同位素稀释技术的固相支持液液萃取净化GCMS方法测定食用植物油中氯丙醇酯总量的检测方法，通过对74份食用植物油样品的检测和参加英国食品分析能力评价项目（FAPAS）国际比对考核，证明本方法简便、灵敏、准确、可靠，为进行食用植物油中氯丙醇酯的膳食暴露评估提供了有力的技术支持。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Agilent7890 GC5975C MS气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）；MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）；G560E涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；NDO400型电热恒温鼓风干燥箱（杭州汇尔仪器设备有限公司）；气密针（1 mL，澳大利亚SGS公司）；NEVAPTM 111型吹氮浓缩仪（美国Organomation Associates公司）。

3氯1，2丙二醇脂肪酸酯（3Monochloropropane1，2diol esters，3MCPD， 纯度98%，德国Aldrich公司）；D53MCPD（纯度>99%，德国DrEhrenstorfer公司）；双氯取代的1，3二氯2丙醇脂肪酸酯（1，3Dichloropropan2olesters，1，3DCP），以及D51，3DCP，2，3DCP和D52，3DCP，纯度均高于97%，购自美国Fluka公司；2MCPD、D52MCPD、3MCPD棕榈酸双酯、D53MCPD棕榈酸双酯、2MCPD硬脂酸双酯和D52MCPD硬脂酸双酯（纯度均≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色谱纯，美国J. T. Baker公司）；冰乙酸（色谱纯，美国Tedia公司）；甲基叔丁基醚（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；七氟丁酰咪唑（HFBI，分析纯，美国Alfa Aesar公司）；甲醇钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；无水Na2SO4（优级纯，经195℃烘烤4 h后使用，天津市津科精细化工研究所）。ChemElutTM硅藻土小柱（5 g，美国Agilent公司）。

植物油样品采集于多个食用油脂生产加工企业；将未检出氯丙醇酯的特级初榨橄榄油样品作为空白基质样品。

2.2标准溶液的配制

氯丙醇及其氘代氯丙醇，氯丙醇酯及其氘代氯丙醇酯标准溶液配制：分别准确称取各氯丙醇、各氘代氯丙醇酯、各氯丙醇酯、各氘代氯丙醇酯标准品适量（精确至0.0001 g），置于不同的10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯定容，分别制备成浓度为1000 mg/L（以氯丙醇计）的标准储备液，于

Symbolm@@ 20℃储存。将氯丙醇和氯丙醇酯标准储备液用正己烷稀释并定容，配制成10 mg/L的标准使用液。

分 析 化 学第44卷

第6期李 珊等： 同位素稀释气相色谱质谱法测定食用植物油中总氯丙醇脂肪酸酯

2.3样品前处理

2.3.1样品水解准确称取0.1 g食用植物油样品，分别加入浓度为10 mg/L的D53MCPD棕榈酸双酯内标使用液102 μL（相当于0.2 μg，以D53MCPD计）、D52MCPD硬脂酸双酯内标使用液116 μL（相当于0.2 μg，以D52MCPD计）和浓度为10 mg/L 的D51，3DCP和D52，3DCP内标使用液20 μL，加入500 μL甲基叔丁基醚乙酸乙酯（8∶2， V/V），涡旋混匀，加入1 mL甲醇钠甲醇溶液（0.5 mol/L），充分振荡，反应4 min后立即加入3 mL冰乙酸10% Na2SO4溶液（1∶29， V/V）和3 mL正己烷，充分涡旋振荡，弃去上层有机相溶液。

2.3.2 样品净化及衍生化将下层水相溶液倒入ChemElutTM硅藻土小柱中，静置10 min，加入15 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，在洗脱液中加入4 g无水Na2SO4，放置5 min 后，过滤至透明具塞玻璃试管中，于35℃氮吹至近干（约200 μL），用2 mL正己烷溶解残渣，涡旋混匀，待进行衍生化反应。用气密针加入40 μL HFBI，立即密塞，涡旋混合20 s，于70℃恒温箱中衍生20 min后，取出冷却至室温，加入10% Na2SO4溶液2 mL，涡旋混合30 s，转移上层有机相， 并加入0.2 g无水Na2SO4除水后，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤于进样小瓶中，供GCMS测定。

2.4分析条件

2.4.1色谱条件 色谱柱：DB 5 MS UI 毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；进样口温度：250℃；程序升温：50℃保持1 min，以2℃/min升至90℃，以40℃/min升至250℃，保持5 min；載气：高纯氦；流速1.0 mL/min；进样体积：1 μL；不分流进样。

2.4.2质谱条件

离子化方式为电子轰击（EI），能量70 eV；选择反应离子监测；电子倍增器电压1000 V； 离子源温度230℃；四极杆温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟8 min。

3结果与讨论

3.1目标化合物的方法学参数的确定

目标化合物经衍生上机测定后，目标化合物衍生物的保留时间和主要质谱参数见表1，质谱裂解图见图2（以3MCPD为例）。

3.2内标的选择

根据文献[17，18]报道，食品中3MCPD棕榈酸双酯的污染水平较高，加之现可采购到商品化标准品，因此，本实验选择D53MCPD 棕榈酸双酯为内标。对于2MCPD酯的内标，只获得商品化的D52MCPD硬脂酸双酯。而对于1，3DCP酯和2，3DCP酯，由于暂不能获得对应的氘代脂肪酸酯，且鉴于其在食品中的污染水平较低，本实验暂以D51，3DCP和D52，3DCP分别代替D51，3DCP酯和D52，3DCP酯作为内标进行实验。

3.3水解液萃取过程中萃取剂的选择

根据文献[9，13]报道，在氯存在时，缩水甘油酯可能转化为氯丙醇酯，故本实验比较了20% NaCl， 10% NaCl， 20% Na2SO4和10% Na2SO4溶液作为萃取剂的实验结果。以2014年英国食品分析能力评价项目（Food analysis performance assessment scheme，FAPAS）的食用植物油考核样品（T2642，其中3MCPD酯的含量为0.579 mg/kg，缩水甘油酯的含量为0.583 mg/kg）和市售菜籽油为研究对象，用以上4种溶液按2.3节实验方法进行氯丙醇酯的测定（表2）。由表2可知，20% Na2SO4溶液作为萃取剂时，测定结果偏低，可能是萃取后下层水相溶液变浑浊，其中的悬浮物吸附了目标化合物；对于含有0.583 mg/kg缩水甘油酯的T2642样品， 20%NaCl溶液和10% NaCl溶液作为萃取剂地增加

会错误

3MCPD酯的含量，即在样品前处理过程中，由于使用了含氯试剂，使缩水甘油酯转化为3MCPD酯[19]。由菜籽油样品的测定结果可知，10% Na2SO4溶液作为萃取剂的效果更佳，且检测结果表明该样品中基本不含有缩水甘油酯。德国脂肪科学学会（DGF）的CⅥ18（10）方法[13]测定缩水甘油酯即是基于此原理。因此，考虑到食用植物油中可能含有缩水甘油酯，本研究采用10% Na2SO4溶液作为萃取剂。

3.4固相支持液液萃取条件的优化

在氯丙醇酯的GCMS测定方法中，大多数以硅藻土进行酯键断裂水解液净化的文献[8，19，20]分别以正己烷为淋洗剂，乙醚为洗脱剂。但实验中发现，采用10 mL正己烷去除油脂和省略此步骤对GCMS检测基本无影响，且长期（两周）连续实验及进样也不会对仪器的离子源造成明显的污染，因此本实验中省略了正己烷淋洗的步骤。

文献中采用无水乙醚作为萃取剂时[8，19，20]，双氯丙醇酯的空白加标回收率较低、响应低，即影响方法的准确度，又影响方法的灵敏度；而且乙醚对人体健康、环境及实验室安全均不利。本实验以空白特级初榨橄榄油样品为基质，比较了15 mL无水乙醚、15 mL乙酸乙酯、15 mL二氯甲烷、7.5 mL二氯甲烷和7.5 mL乙酸乙酯顺序洗脱，以及15 mL乙酸乙酯二氯甲烷混合液（1∶1， V/V）作为萃取剂的固相支持液液萃取效果。由于本方法采用内标法定量，虽然有些萃取剂的萃取效果不佳，

但考虑到方法的灵敏度，本实验以待测物的峰面积作为评价萃取效果的指标。实验结果（图3）表明，乙醚和二氯甲烷的萃取效率较其它3种萃取剂低，乙酸乙酯和二氯甲烷顺序萃取对1，3DCP的萃取效率较低，而乙酸乙酯与乙酸乙酯二氯甲烷（1∶1， V/V）的萃取效率相当。因此，实验最终选用乙酸乙酯为萃取剂。

3.5线性范围及检出限和定量限

在所确定的实验方法条件下，取氯丙醇系列标准工作液（浓度分别为0.05， 0.1， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6和2.0 mg/L，其中同位素内标浓度均为0.1 mg/L）各2 mL，经HFBI衍生后，以GCMS测定。以氯丙醇标准衍生物的色谱峰面积与其对应的内标衍生物的色谱峰面积之比为纵坐标，氯丙醇与其对应内标的浓度比为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，在0.05～2.0 mg/L范围内，3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP的衍生物均呈良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.9995（表1）。当样品中的氯丙醇酯浓度超过上述线性范围时，可以正己烷适当稀释样品后再进行检测。

以空白特级初榨橄榄油样品中添加4个浓度水平10， 15， 30和50 mg/kg的标准，以3倍信噪比（S/N=3）的响应对应的含量为检出限，以空白加回收实验中的最低加标水平为定量限。3MCPD酯和2MCPD酯的检出限均为0.015 mg/kg，定量限均为0.050 mg/kg；1，3DCP酯和2，3DCP酯的检出限均为0.030 mg/kg，定量限均为0.100 mg/kg（表1）。

3.6空白加标回收实验

在0.05～1.0 mg/kg范围内，在空白特级初榨橄榄油样品中分别添加4个不同浓度水平的3MCPD棕榈酸酯、2MCPD硬脂酸酯、1，3DCP和2，3DCP的标准溶液，按2.3和2.4实验方法进行测定，每个浓度水平做6 份平行样品，回收率和相对标准偏差结果见表3。由表3可知，4种氯丙醇酯的平均回收率在87.0%～110.5%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10.1%；空白加标回收实验结果表明，本方法的精密度和准确度良好。

3.7本方法与不同氯丙醇酯检测方法的比较

将本方法与采用间接法的美国油脂化学家协会的AOCSCd 29c13方法[2]、德国脂肪协会的DGFCVI18（10）方法[13]和相关文献报道的方法进行了比较，详见表4。這5种检测方法均是以食用植物油和油

脂作为研究对象，且样品检测的取样量均为0.1 g；从方法的灵敏度来看，本方法的灵敏度最高，单氯丙醇酯的检出限为0.015 mg/kg，双氯丙醇酯的检出限为0.030 mg/kg；就检测的氯丙醇酯种类而言，方法4[8]和本方法采用HFBI衍生，能够测定全部4种氯丙醇酯，而其它方法只能检测3MCPD酯和/或2MCPD酯。与其它方法相比，本方法在操作简单、经济、环境友好以及方法的灵敏度方面亦具有一定的优势。

3.8实际样品的测定

本方法参加了2014年9～10月FAPAS的食用植物油中氯丙醇酯的国际比对考核（T2642），并提交了3MCPD酯的测定结果0.705 mg/kg（在此次考核提交结果时，将测定值0.601 mg/kg以同批次的空白加标回收率85.2%进行了校正），最终发布的结果为T2642食用植物油考核样品的统计值为0.579 mg/kg，本实验室的Z评分为1.1，成绩合格，再次证明本方法的可靠性，其总离子流图如图4。

对采集的74份食用植物油样品进行氯丙醇酯的测定，3MCPD酯、2MCPD酯和1，3DCP酯的检出率分别为94.6%， 63.5%和5.4%，含量范围分别为ND～10.646 mg/kg、ND～3.617 mg/kg和ND～0.089 mg/kg， 未检出2，3DCP酯（表5）。其中，棕榈油、芝麻油和玉米油样品中3MCPD酯和2MCPD酯检出率为100%；除1份菜籽油、1份大豆油、1份花生油和1份橄榄油样品中未检出3MCPD酯，其余70份样品中均检出3MCPD酯；其中1份精炼稻米油样品中3MCPD酯含量超过了10 mg/kg；大豆油和花生油样品中3MCPD酯和2MCPD酯的污染水平较低；而茶籽油、稻米油、棕榈油和部分菜籽油样品中3MCPD酯和2MCPD酯污染水平较高，尤其是棕榈油污染水平最高；橄榄油中3MCPD酯的污染水平最低，且未检出2MCPD酯。在所有食用植物油品种中，棕榈油是氯丙醇酯污染水平普遍较高的品种。

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