杏鲍菇多糖的提取及其对RAW264.7细胞吞噬活性·NO释放的影响

王海洋 杨献玲 韩苗苗等

摘要[目的]以杏鮑菇多糖的理化性质作为综合评价指标，提取杏鲍菇多糖，并研究其对RAW264.7细胞吞噬活性的作用及对NO释放的影响。[方法]采用水煎煮提取、超声提取、90 ℃热水浸提、70 ℃热水浸提、50 ℃热水浸提提取杏鲍菇多糖，并采用苯酚-硫酸法、间羟基联苯法以及Lowry法测定其总糖、酸性糖和蛋白质含量；采用PMP柱前衍生化法和HPGPC法测定其组成糖和分子量分布；采用吞噬中性红法和Griess试剂盒法测定其吞噬能力及NO的释放量。[结果]试验得出，50 ℃热水浸提提取的多糖总糖含量最高，超声提取的多糖蛋白质含量最高，各组提取酸性糖含量相当且均较低，水煎煮提取多糖中的单糖种类最少、分子量最低。综合比较，90 ℃热水浸提为杏鲍菇多糖的最佳提取方法；在质量浓度为25～100 μg/mL，能够极显著地促进细胞吞噬中性红的能力和NO的释放。[结论]90 ℃热水浸提水煎煮为杏鲍菇多糖的最佳提取方法，一定浓度的杏鲍菇多糖能够提高RAW264.7细胞的吞噬活性，并能促进NO的释放，提示杏鲍菇多糖具有一定的免疫活性。

关键词杏鲍菇多糖；提取；理化性质；吞噬指数；一氧化氮

中图分类号S646文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-116-04

Extraction of Pleurotus eryngii Polysaccharides and Its Effects on the Macrophages Activity of RAW264.7 Cell and the Release of NO

WANG Haiyang1， YANG Xianling2， HAN Miaomiao3， XU Duoduo1* et al（1. Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117； 2. Jilin Institute for Drug Control， Changchun， Jilin 130033； 3. Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao， Shandong 266555）

Abstract[Objective] With the physicochemical property of Pleurotus eryngii polysaccharides as the comprehensive evaluation index， polysaccharides were extracted from P. eryngii； and its effects on the macrophages activity of RAW264.7 cell and the release of NO were researched. [Method] Polysaccharides were extracted from P. eryngii by the methods of water decoction extraction （A）， ultrasonic extraction （B）， 90 ℃ hot water extraction （C）， 70 ℃ hot water extraction （D） and 50 ℃ hot water extraction （E）. Contents of total glucose， acid glucose and protein were detected by phenolsulfuric acid method， mhydroxydiphenyl method and lowry method. Glucose component and molecular weight distribution were detected by PMP precolumn derivatization method and HPGPC method. Phagocytic ability and NO release were detected by neutral red method and Griess kit method. [Result] Polysaccharides and total glucose contents were the maximum in 50 ℃ hot water extraction. Polysaccharides and protein contents were the maximum in ultrasonic extraction. Acid sugar content in each group was relatively low. Monosaccharide type was relatively less in polysaccharides， and molecular weight was relatively low in water decoction extraction. 90 ℃ hot water extraction was the maximum extraction method. 25-100 μg/mL significantly promoted the phagocytic ability and NO release. [Conclusion] 90 ℃ hot water extraction is the optimal extraction method for P. eryngii polysaccharides. A given concentration of P. eryngii polysaccharides enhances the phagocytic activity of RAW264.7 cells， and promotes the NO release， indicating that P. eryngii polysaccharides have certain immunocompetence.

Key wordsP. eryngii polysaccharides； Extraction； Physical and chemical properties； Phagocytic index； NO

是机体内重要的免疫细胞，属于免疫系统的“哨兵”，是继黏膜屏障之后的机体第2道防御体系，参与抗原处理并将抗原递呈给免疫活性细胞，是连接先天免疫和获得免疫的纽带，在去除病原体、抗肿瘤及一些慢性炎症疾病中具有不可替代的作用[1]。现代研究表明，巨噬细胞具有免疫防御、监视、调节等免疫功能，是生物体重要的免疫效應细胞，在生物体的免疫系统中发挥着不可替代的作用，它通过吞噬作用和分泌多种细胞因子等多种功能而调控机体的免疫应答[2]。

杏鲍菇（Pleurotus eryngii），别名刺芹侧耳，属侧耳（口蘑）科（Pleurotaceae）侧耳属（Agaricochaete），是一种十分重要的药食同源的珍稀食用菌，目前在我国已经成为继金针菇之后的第二大工业化栽培品种[3]。杏鲍菇子实体营养丰富，含有大量的蛋白质、氨基酸、还原性糖、不饱和脂肪酸等膳食纤维，具有很高的营养价值[4]。现代药理研究表明，杏鲍菇的主要活性成分为多糖组分，其具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、抗疲劳、降低胆固醇等功效[5-9]。目前，针对各种方法提取杏鲍菇多糖的工艺条件报道有很多[10-13]，但针对各提取方法得到的多糖的理化性质、组成糖、分子量差异及免疫活性却鲜见报道。笔者采用不同方法提取杏鲍菇多糖，比较其理化性质、组成糖及分子量差异，并初步研究其免疫活性，旨在为杏鲍菇的进一步资源开发利用提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1材料原料及主要试剂：杏鲍菇，购自吉林农业大学菌菜基地，菌种号：Pleurotus eryngii 2601；右旋糖酐（Dextran）及甘露糖等标准品、脂多糖（LPS）、中性红，均购自美国Sigma公司；RAW264.7细胞，购自中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基等，购自美国Gibco公司；3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT），美国Amresco；小鼠Griess试剂盒，美国Promega公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为超纯水。主要仪器：MCO15AC 二氧化碳恒温培养箱，日本SANYO公司；MK3酶标仪，美国Thermo公司。

1.2方法

1.2.1杏鲍菇多糖的提取。将新鲜杏鲍菇用清水洗净，切成小块，风干，于95%乙醇中室温浸泡24 h后过滤，将滤渣烘干，备用。试验共分为5组，每组100 g，分别为水煎煮提取（A）、超声提取（B）、90 ℃热水浸提（C）、70 ℃热水浸提（D）、50 ℃热水浸提（E）。每次提取1 h，提取3次，分别过滤、浓缩、放至室温，缓慢向其加入无水乙醇至乙醇浓度为80%，放置过夜，离心（3 000 r/min，5 min），取沉淀，挥去乙醇，冻干，即得杏鲍菇多糖样品[14]，备用。

1.2.2理化性质的测定。分别采用苯酚-硫酸法[15]、间羟基联苯法[16]、Lowry法[17]测定所提取多糖的总糖、酸性糖和蛋白质含量。

1.2.3组成糖分析。采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法，参照文献[18]步骤制备衍生化产物，根据单糖标准品与样品的保留时间确定单糖种类。

色谱条件：Agilent 1200高效液相色谱仪，Grace Apollo C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱；以不同比例0.025 mol/L磷酸盐缓冲液（KH2PO4NaOH，pH 6.8）-乙腈作为流动相，梯度洗脱比例见表1；流速0.8 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为250 nm。

1.2.4分子量分析。采用高效凝胶分子排阻色谱法进行测定[19]。

1.2.4.1色谱条件。TSK G3000PWxl凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm）、TSK guard column PWML预柱（40 mm×6.0 mm），流动相为0.7%Na2SO4溶液（内含0.02%叠氮钠），流速0.5 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL，RI201H检测器。

1.2.4.2对照品溶液的制备。精密称取已知分子量的Dextran T180、T1000、T5000、T12000、T25000的葡聚糖对照品，加流动相配制成5 mg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，作为对照品溶液。

1.2.4.3供试品溶液的制备。取样品适量，加入流动相配制成浓度为5 mg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

1.2.5杏鲍菇多糖的吞噬活性及NO含量的测定[20]。RAW264.7细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（含1%双抗）中，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，每隔2～3 d更换新鲜培养液，待细胞长满瓶底80%时，消化、传代。取对数生长期的细胞用于试验。

1.2.5.1杏鲍菇多糖对RAW264.7细胞的影响。将细胞消化调整至1×105个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养24 h后弃去培养液，每孔加入不同质量浓度各多糖溶液（0、1.50、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1 000.00 μg/mL）100.00 μL，置于培养箱中培养24 h后，采用MTT比色法测定其吸光度（A）值。每组5个复孔。

1.2.5.2杏鲍菇多糖对RAW264.7细胞吞噬作用的影响。细胞处理同“1.2.5.1”。试验分为3组，分别为空白组、对照组和给药组。空白组加入100 μL新鲜培养液；对照组每孔分别加入10 μg/mL LPS溶液；给药组加入质量浓度为1.50、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的多糖溶液。将各组置于培养箱中继续培养。培养24 h后倾去液体，每孔加入0.075%的中性红溶液进行染色，1 h后倾去染色液，用磷酸盐缓冲液清洗3次，每孔各加入100 μL醋酸乙醇（V/V=1∶1）细胞溶解液，室温放置过夜，次日于酶标仪在波长492 nm下测定吸光度值。细胞对中性红吞噬能力用吞噬指数（pinocytotic index，PI）表示。

吞噬指數=A试验A空白×100%

1.2.5.3NO含量的测定。将细胞消化调整至1×105个/mL接种于6孔板中，每孔1 mL，于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养24 h后弃去培养液，每孔加入1 mL质量浓度为1.50～100.00 μg/mL的多糖溶液，继续培养24 h后吸取上清液，离心，取上清，按Griess试剂盒操作计算NO的释放量。

1.2.6统计学分析。采用SPSS统计软件进行分析，计量数据用±S表示，用单因素方差分析组间差异，以P<0.05具有统计学意义。

2结果与分析

2.1粗多糖的理化性质测定结果由表2可知，E组提取得到的多糖总糖含量最高，A组提取多糖的总糖含量最低；各组提取得到的酸性糖含量均较低且含量相当；B组提取得到的杏鲍菇多糖的蛋白质含量最高。

A、C、D、E组的总糖含量显示，随着提取温度的降低，所得多糖的总糖含量呈上升趋势，但对酸性糖和蛋白质含量影响不大；超声的空化效应能促进蛋白质类成分溶出；在水煎煮过程中，温度过高，会将某些多糖组分破坏，同时也会提取出较多非糖类杂质，使总糖含量下降。

2.2组成糖测定结果由表3可见，各组提取多糖均含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖4种单糖。B、C、D、E组提取的杏鲍菇多糖单糖组成相同，只有A组提取多糖不含葡萄糖醛酸，可能的原因是在水煎提取过程中的过高温度使葡萄糖醛酸受到破坏。

2.3分子量测定结果高效凝胶色谱法（HPGPC）结果显示，A组提取的杏鲍菇多糖分子量较小，分子量分布大于20 000 D的仅占7.73%，其分子量主要分布在300～2 000 D；C组提取多糖分子量相对较高，分子量分布在20 000 D的占55.02%；其余各组多糖分子量分布基本相同，主要集中分布在500～15 000 D。由此可见，水煎煮提取的过高温度可能使多糖组分中高分子部分受到破坏，使其分子量变小。

2.4杏鲍菇多糖对RAW264.7细胞吞噬作用及NO含量的影响

2.4.1杏鲍菇多糖对RAW264.7细胞的影响。由图1可知，在试验浓度下，杏鲍菇多糖直接作用于RAW264.7细胞时，能够促进RAW264.7细胞增殖，并且，随着浓度的增大，增殖率随之升高。在质量浓度为1.50～100.00 μg/mL时，杏鲍菇多糖作用于RAW264.7细胞与空白组无明显差异；200.00 μg/mL能显著促进RAW264.7细胞增殖；400.00～1 000.00 μg/mL能极显著促进RAW264.7细胞增殖。

4.7细胞的影响

Fig.1Effects of polysaccharides in different concentration groups on RAW264.7 cells2.4.2杏鲍菇多糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响。由图2可知，各组提取的多糖在试验浓度下均能促进RAW264.7细胞吞噬中性红的能力，并且，随着浓度的增高，其吞噬指数也随之增大。在质量浓度为12.50 μg/mL时与空白组相比具有显著性差异；在质量浓度为25.00～100.00 μg/mL时与空白组相比具有极显著性差异；在质量浓度为100.00 μg/mL时，其吞噬指数大于LPS对照组，提示杏鲍菇多糖具有活化RAW264.7巨噬细胞、提高吞噬能力的作用，可保护机体免受抗原感染。

3结论与讨论

多糖作为良好的免疫调节剂，其免疫活性越来越受到国内外广大学者的广泛关注，巨噬细胞是免疫系统中的“哨兵”，它会传递病原体的信息给淋巴细胞，以此来激活免疫应答，所以这类细胞在机体的免疫反应中起着重要的作用。

NO是一种新型的生物活性信息递质，具有重要的免疫学功能，在免疫、神经和呼吸等多个系统中均发挥着重要作用，并且广泛参与到机体的免疫反应、炎症反应等多种生理和病理过程中，与获得性免疫、细胞因子的分泌以及自身免疫病都密切相关[21]。

该研究以杏鲍菇作为研究对象，分别采用水煎煮法、超声提取法以及不同温度的热水浸提提取杏鲍菇多糖，研究不同提取方法下杏鲍菇多糖的理化性质、组成糖、分子量差异。结果显示，不同提取方法对杏鲍菇多糖的免疫活性影响不大，随着提取温度的升高，会有许多非糖类物质溶出，同时多糖分子中的某些组分会受到破坏，使总糖含量相对降低，分子量降低。

以小鼠单核巨噬RAW264.7细胞作为试验对象，通过分析细胞的增殖能力、吞噬能力、NO释放水平来探讨杏鲍菇多糖的免疫调节活性。结果显示，杏鲍菇多糖直接作用于RAW264.7细胞能够激活巨噬细胞，提高其吞噬能力，促进其释放NO，提示杏鲍菇多糖具有免疫调节活性，是一种良好的免疫调节剂[22]，这为其开发成为免疫调节药物提供了一定的试验依据，并有待于进一步研究。

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