酶Sevag法除酸浆果实多糖蛋白工艺的研究

徐丹鸿 王爽 林道鹏

摘要[目的]优化木瓜蛋白酶Sevag法去除酸浆（Physalis alkekengi L.）果实多糖中蛋白质的工艺条件。[方法]以蛋白脱除率和多糖保留率为指标，通过对酶解温度、时间、pH及酶添加量进行单因素试验及L9（34）正交试验确定酶解条件，并结合Sevag试剂除蛋白。[结果]各因素对酶解法脱酸浆果多糖液蛋白的影响程度大小依次为：酶解温度、酶解时间、pH、酶添加量。在酶解温度60 ℃、酶解时间2.0 h、pH 6.0、酶添加量2.5%条件下，粗多糖液蛋白脱除率为62.07%，多糖保留率为93.16%。原料经酶处理后，可使游离蛋白和部分与多糖结合的蛋白质被水解，再经Sevag试剂（氯仿∶正丁醇为4∶1）处理2次，蛋白质脱除率为81.65%，多糖保留率为89.43%，可达到较理想的脱蛋白质效果和较高的粗多糖保留率。[结论] 采用酶和Sevag试剂相结合的方法除酸浆果多糖中的蛋白质，效果良好，操作简单，可为酸浆果多糖的纯化提供理论依据，但其对多糖结构和生物活性的影响还有待于进一步研究。

关键词酸浆果多糖；脱蛋白；木瓜蛋白酶；Sevag法

中图分类号S509.9文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-113-03

Protein Removal from Polysaccharide by EnzymesSevag Process

XU Danhong， WANG Shuang， LIN Daopeng（Heilongjiang Ecological Engineering Professional College， Harbin， Heilongjiang 150025）

Abstract[Objective] The aim was to optimize conditions for removing protein from Physalis alkekengi polysaccharide with papainSevag method. [Method] With protein removal rate and polysaccharide retention rate as indicators， the single factor experiment was carried out by the enzyme hydrolysis temperature， time， pH and enzyme addition and L9 （34） orthogonal experiment. And combined Sevag reagent for removing protein. [Result] Influence of enzymatic deacidification of polysaccharide protein was the enzymolysis temperature > hydrolysis time>pH enzyme dosage. The optimum technological conditions were 60 ℃of hydrolysis temperature， hydrolysis time of 2.5 h， pH 6.0， enzyme adding amount of 2.5%， the removal rate of protein was 62.07% and the retention rate of polysaccharide was 93.16%. After the material processed by the enzyme， the free protein and the part of the protein which is combined with the polysaccharide can be hydrolyzed， and then treated for 2 times by Sevag reagent（chloroform Butyl alcohol 4∶1）， the removal rate of protein was 81.65% and the retention rate of polysaccharide was 89.43%. [Conclusion] Using papainSevag method to remove protein from Physalis alkekengi polysaccharide has a good effect and simple operation， which can provide theoretical basis for purification of Physalis alkekengi polysaccharide， but its effect on polysaccharide structure and biological activity remains to be further studied.

Key wordsPhysalis alkekengi L. polysaccharide； Removal of protein； Papain； Sevag method

酸漿（Physalis alkekengi L.）在我国分布广泛，尤其是在东北地区，具有对气候适应性强，耐寒、耐旱，易于人工栽培等特点，其全草皆可入药，是我国医书中记载的一种常用中药[1]。关于酸浆果实中的活性成分，已有学者对酸浆果实的多糖进行了分析和测定[2-3]，但从天然动植物中提取的多糖，常与蛋白形成糖蛋白复合物，使蛋白质的脱除比较困难，因此脱蛋白是多糖制备过程中一个重要的环节[4]。目前，国内对粗多糖脱蛋白的方法主要有Sevag法、三氟三氯乙烷法、外三氯乙酸法、酶法、盐酸法、树脂法等[5]。其中，酶法利用蛋白酶将粗多糖中的蛋白质水解，条件温和，效率高，但会引入新的蛋白质杂质；而Sevag法是利用蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，达到去除蛋白质的目的，可避免糖降解，但效率不高[6]。所以，酶与Sevag法结合除蛋白，可取得较好的效果。

目前关于酸浆果实多糖中除蛋白方法的研究报道并不多见，笔者在酸浆果实多糖提取工艺的基础上，采用酶和Sevag试剂相结合的方法研究酸浆果实多糖脱蛋白工艺，通过对各工艺参数进行单因素试验和正交试验，确定最佳工艺条件，以期为酸浆果实多糖分离纯化提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原材料。酸浆果实购买于哈尔滨地区，经烘干、粉碎，过40目筛备用，经热水浸提制得酸浆果实粗多糖粉末。

1.1.2主要试剂。木瓜蛋白酶（>50万U/g）、考马斯亮蓝、牛血清白蛋白、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、苯酚等，均为分析纯化学试剂。

1.1.3主要仪器。紫外分光光度计（T6新世纪），北京普析通用仪器有限公司；循环水真空抽滤泵（SHZD），巩义市予华仪器有限公司；电子分析天平（ESJ4），沈阳龙腾电子有限公司；旋转蒸发仪（TY10RE2000A），北京中仪友信有限公司；离心机（TD5A），湖南凯达科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1酸浆果实粗多糖液的制备。准确称取酸浆果粗多糖粉末0.501 0 g，室温下加入少量蒸馏水溶解，转置于250 mL容量瓶中稀释至刻度，摇匀。

1.2.2木瓜蛋白酶法除蛋白的单因子试验。

1.2.2.1酶解温度的筛选。量取等量的粗多糖液，加入底物1.5%的木瓜蛋白酶，分别在温度30、40、50、60、70 ℃条件下，pH 6.0，水解1.0 h，研究不同酶解温度对蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。

1.2.2.2酶解时间的筛选。量取等量的粗多糖液，加入底物1.5%的木瓜蛋白酶，在温度60 ℃，pH 6.0，分别水解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，研究不同酶解时间对蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。

1.2.2.3酶解pH的筛选。量取等量的粗多糖液，加入底物1.5%的木瓜蛋白酶，在温度60 ℃，分别在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的条件下酶解1.0 h，研究不同酶解pH对蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。

1.2.2.4酶添加量的筛选。量取等量的粗多糖液，分别加入底物0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的木瓜蛋白酶，在温度60 ℃，pH 6.0，水解1.0 h，研究不同酶添加量对蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。

1.2.3 木瓜蛋白酶法除酸浆果实粗多糖的正交试验。在单因素试验的基础上，选取酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶添加量4个因素，每个因素3个水平，采用L9（34）进行正交试验，正交试验因素水平设计见表1。

1.2.4酶Sevag法。在酶法脱蛋白的最佳条件下处理酸浆果实粗多糖液，然后置于100 ℃沸水浴中使蛋白酶失活，冷却至室温，按样液与Sevag试剂（氯仿∶正丁醇4∶1）比为4∶1，充分振摇30 min，离心（4 000 r/min，5 min）去除沉淀，分出上清液，测糖浓度和蛋白质浓度，计算多糖保留率和蛋白质脱除率。

1.2.5测定项目及方法。多糖含量测定方法采用苯酚-硫酸法[7]；蛋白質含量测定方法[8-9]采用考马斯亮蓝法。以牛血清蛋白为标准品，绘制标准曲线：精密称取牛血清蛋白0.100 g溶于蒸馏水中，定容得到1 mg/mL牛血清蛋白标准液，分别取1、2、3、4、5、6 mL于100 mL容量瓶中定容至100 mL，配成浓度为10、20、30、40、50、60 μg/mL的溶液，再分别取1 mL，加入考马斯亮蓝G250溶液5 mL（100 mg溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1 000 mL），在595 nm波长下测定吸光度值。标准曲线见图1。蛋白质脱除率及多糖损失率计算公式如下：

2结果与分析

2.1木瓜蛋白酶法除蛋白的单因素试验

2.1.1酶解温度对酸浆果实粗多糖蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。由图2可知，酶解温度30～60 ℃时蛋白质脱除率随着温度的升高而增加，多糖保留率变化不显著，而超过60 ℃后，蛋白脱除率有所下降，同时多糖保留率也有所下降，说明随着温度过高，木瓜蛋白酶的活力降低，也会造成多糖的少量分解。故酶法脱蛋白选用温度为40、50、60 ℃进行正交试验。

1.2酶解时间对酸浆果实粗多糖蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。由图3可知，酸浆果实粗多糖液的蛋白质脱除率随着酶解时间增加而增加，反应时间在2.0～3.0 h时，脱蛋白率由55.42%增加至59.41%，而此时多糖保留率由93.46%降2.1.3酶解pH对酸浆果实粗多糖蛋白质脱除率和多糖保留率的影响。如图4所示，酶的活力受pH的影响，在pH 5.5时，蛋白质脱除率达到最高，为55.22%；而多糖保留率却随着pH的升高而增加，说明较低的pH条件下，会导致多糖水解，含量下降。因此，综合考虑蛋白质脱除率及多糖保留率，选择选木瓜蛋白酶反应的pH为5.5、6.0、6.5进行正交试验。

2.1.4酶添加量对酸浆果实粗多糖蛋白质脱除率及多糖保留率的影响。如图5所示，不同酶的添加量对粗多糖保留率影响不显著，而蛋白质脱除率随着酶添加量的增加而增加，当酶的添加量为2.0%，蛋白质脱除率增加趋于平缓。因此，选木瓜蛋白酶的添加量为2.0%、2.5%、3.0%进行正交试验。

2.2木瓜蛋白酶法除酸浆果实粗多糖的正交试验在单因素试验确定的酶解条件下，粗多糖保留率变化不明显，因此正交试验中以蛋白质脱除率为参考指标确定最佳酶处理条件，结果见表2。

正交试验分析结果表明，4个因素对酶解法脱蛋白的影响程度大小依次为：酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶添加量。正交试验优化条件为：A3B2C2D2，即酶解温度60 ℃、酶解时间2.0 h、酶解pH 6.0、酶添加量2.5%，经试验验证，此条件下粗多糖液蛋白质脱除率为62.07%，多糖保留率为93.16%。说明试验效果良好，验证了最佳酶解条件的正确性。

44卷4期徐丹鸿等酶-Sevag法除酸浆果实多糖蛋白工艺的研究2.3酶Sevag法按照酶法脱蛋白质的最佳条件，即在酸浆果实粗多糖液添加2.5%的木瓜蛋白酶，pH 6.0，温度60 ℃、酶解2.0 h后置于100 ℃沸水浴中使蛋白酶失活，冷却至室温，按样液与Sevag试剂（氯仿∶正丁醇4∶1）比为4∶1，充分振摇30 min，离心（4 000 r/min，5 min）去除沉淀，分出上清液，测糖浓度和蛋白质浓度，计算多糖保留率和蛋白质脱除率。

从图6可看出，酶法与Sevag法连用条件下，粗多糖中蛋白质的脱除率也随着处理次数的增加而升高，多糖保留率有所下降。酶Sevag法处理2次与酶Sevag法处理3次，蛋白质脱除率差异不明显。原料经酶处理后，可使游离蛋白和部分与多糖结合的蛋白质被水解，经过2次处理后基本可达到理想的去除蛋白质的效果，同时提高了粗多糖的保留率。