牛膝醇提物对兔骨关节炎模型的疗效比较

陈达　廖州伟　马笃军　王立新　彭力平广州中医药大学深圳临床医学院广东省深圳市中医院，广东深圳518033

牛膝醇提物对兔骨关节炎模型的疗效比较

陈达廖州伟马笃军王立新彭力平▲
广州中医药大学深圳临床医学院广东省深圳市中医院，广东深圳518033

目的比较牛膝醇提物（AEAB）与硫酸氨基葡萄糖和双醋瑞因对于兔骨关节炎（OA）的疗效。方法将35只实验兔采用随机区组分组法分为正常组、模型组、AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组，每组7只。石膏固定制动6周制备OA模型，造模后，分别以蒸馏水、AEAB、硫酸氨基葡萄糖及双醋瑞因灌胃，正常组不予处理，6周后处死实验兔，取软骨标本进行大体观察、Pelletier评分、Mankin评分，用免疫组化测定软骨Ⅱ型胶原蛋白含量，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清和关节液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）以及基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的含量。结果AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组Pelletier评分、Mankin评分、Ⅱ型胶原蛋白含量、血清和关节液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量分别与正常组、模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；AEAB组与硫酸氨基葡萄糖组及双醋瑞因组比较，上述指标差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论AEAB可以促进兔OA模型的软骨修复，其疗效与硫酸氨基葡萄糖及双醋瑞因相当，具有较高的临床应用价值。

牛膝醇提物；骨关节炎；硫酸氨基葡萄糖；双醋瑞因；疗效

［Abstract］Objective To compare the effects of alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix（AEAB），glucosamine sulfate and Diacerein in the treatment of rabbits with osteoarthritis（OA）.Methods With blocked randomization，thirtyfive experimental rabbits were divided into normal group，model group，AEAB group，glucosamine sulfate group，Diacerein group，with 7 rabbits in each group.The OA models were established by immobilizing rabbits，knees with plaster cast for 6 weeks，and distilled water，AEAB，glucosamine sulfate，Diacerein were respectively given by lavage after modeling.Normal group was not treated.The experimental rabbits were killed six weeks later，and the cartilage samples were taken to perform gross observation，Pelletier score，Mankin score，and the typeⅡcollagen was measured by immunohistochemistry method and the tumor necrosis factor alpha（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β）and matrix metalloproteinase-3（MMP-3）in serum and joint fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method. Results There were all statistically significant differences of Pelletier score，Mankin score，content of typeⅡcollagen，TNF-α，IL-1β and MMP-3 in AEAB group，glucosamine sulfate group，Diacerein group compared with normal group and model group respectively（P＜0.05 or P＜0.01），while there were no statistically significant differences in aforementioned indexes among AEAB group，glucosamine sulfate group and Diacerein group respectively（all P＞0.05）. Conclusion AEAB can promote the cartilage repair in rabbits with OA，and it has equivalent effects with glucosamine sulfate and Diacerein，so it has high value in clinical application.

［Key words］Alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix；Osteoarthritis；Glucosamine sulfate；Diacerein；Effects

骨关节炎（OA）是以关节软骨退行性变为核心病理改变的慢性关节疾病，硫酸氨基葡萄糖和双醋瑞因作为治疗OA的西药代表，可以预防OA的进一步发展和促进软骨修复［1-2］。目前有研究证实［3］，部分中药也有促进软骨修复的作用。本课题组前期实验表明，牛膝醇提物（AEAB）能增加兔关节软骨细胞增殖［4-5］。本研究进一步探讨了AEAB促进软骨修复的机制，并比较了其与硫酸氨基葡萄糖和双醋瑞因对OA的疗效，希望为临床应用AEAB治疗OA提供依据和指导。

1　材料与方法

1.1实验动物

健康新西兰兔35只，兔龄2～3个月，体重（1.86± 0.52）kg，雌雄不限，由广东省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（粤）2014-0035；动物饲料许可证号：SCXK（粤）2013-0002。本研究遵循了单位、地区以及国家所制订的有关实验动物保护和使用的指南，并经实验动物伦理委员会批准。

1.2实验药物及试剂

硫酸氨基葡萄糖（信东生技股份有限公司提供，批号：7KB0102，国药产品注册证号：HC20120036）；双醋瑞因（昆明积大制药股份有限公司提供，批号：国药准字J201000150，进口药品注册证号：H20100350）；AEAB（深圳市中医院提供，批号：20150731）；Rabbit肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）Kit（货号：AE90301Rb）、Rabbit白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA Kit、（货号：AE90731Rb）、Rabbit基质金属蛋白酶-3（MMP-3）ELISA Kit（货号：3460）由AMEKO公司提供；免疫组化第一抗体Anti-Collagen TypeⅡ由德国默克密理博公司提供（货号：CP18-100UGCN）。

1.3 AEAB的制备

依据《中国药典》［6］浸渍法制备：每毫升醇提液相当于含原材料1 g。

1.4实验方法

1.4.1实验分组健康新西兰兔35只，适应性喂养1周后采用随机区组分组法进行分组，分为正常组、AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组、双醋瑞因组及模型组，每组各7只，一兔一笼进行标准喂养，每天观察实验兔的食量、大小便、活动度、步态及精神状况。

1.4.2造模方法参考曾俊华等［7］的实验研究进行造模：将兔右膝关节用棉垫包裹好后于伸直位管型石膏固定制动6周，每天记录实验兔肢端血液循环及石膏稳定度情况，若发现石膏松动脱落，立即重新打制石膏固定，若发现石膏过紧，肢端血液循环差、掉毛、皮肤坏死及溃疡等情况，立即用石膏剪调整石膏松紧度。

1.4.3药物干预参照药理试验中动物与人体间的等效剂量进行换算：结合体重按相应剂量用蒸馏水稀释成10 mL后连续灌服6周：牛膝组：1 mg/（kg·d）；硫酸氨基葡萄糖组：77 mg/（kg·d）；双醋瑞因：5.1 mg/（kg·d），每天灌胃2次，模型组：蒸馏水10 mL，每天灌胃2次；正常组不予处理。

1.4.4 ELISA法检测血清和关节液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量自兔耳缘静脉取血10 mL，取血清。将兔麻醉，造模膝关节剪毛、消毒，用l mL生理盐水冲洗关节腔，抽出冲洗液，3000 r/min离心10 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有标本均采集完毕后，采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量，具体操作严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.4.5关节软骨常规病理学检测灌胃6周后将全部实验兔以空气栓塞法处死，将右膝关节上下1.0～1.5 cm处用锐器切断，整块取下股骨髁部和胫骨平台，首先按Pelletier原则［8］进行关节软骨大体形态学观察评分，分值越高说明软骨退变越严重；将一部分软骨标本处理后进行免疫组化染色，测定Ⅱ型胶原蛋白表达含量情况，用阳性百分率表示；然后将另一部分软骨标本行HE染色，光镜下观察组织形态变化，采用改良Mankin法［9］对结构、细胞、染色以及潮线的完整性进行评分，评分越高说明软骨退变越严重。

1.5统计学方法

用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用成组设计的q检验；组织病理学评分则采用Kruskal-Wallis法检验组间差异；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1动物一般情况

实验期间有2只实验兔有腹泻症状，予土霉素灌胃1～2 d后均好转；其余实验兔健康状况良好。

2.2软骨组织大体观察、Pelletier评分、HE染色、Mankin评分

正常组软骨结构未见异常，软骨细胞数目正常，软骨细胞呈圆形，散在分布，基质染色呈浅红色，潮线结构稳定；模型组软骨表面可见不规则裂隙达辐射层，软骨细胞数目减少、结构紊乱，伴炎症细胞浸润，可见簇集样细胞团形成，局部基质染色变浅，局部可见多重潮线；AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组局部软骨表面可见不规则裂隙达钙化层，软骨细胞数量增多，基质染色呈浅红色，潮线结构稍正常（图1）。Pelletier评分和Mankin评分在正常组与模型组，以及正常组、模型组分别与AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），在AEAB组与硫酸氨基葡萄糖组及双醋瑞因组组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1　各组兔软骨组织HE染色结果（100×）

表1　各组Pelletier评分、Mankin评分比较（分，x±s）

2.3免疫组化测定Ⅱ型胶原蛋白表达含量

正常组Ⅱ型胶原蛋白表达含量与模型组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组提示Ⅱ型胶原表达量增加，结构纹理清晰，三组与正常组及模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。三组两两比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。见图2（封三）、表2。

表2　各组Ⅱ型胶原蛋白表达含量比较（%，x±s）

2.4各组血清和关节液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比较

正常组血清和关节液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量与模型组比较，差异均有高度统计学意义（均P＜0.01）；模型组分别与AEAB组、硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组比较，差异均有高度统计学意义（均P＜0.01），表明三者对兔OA均有较好的治疗效果；AEAB组与硫酸氨基葡萄糖组和双醋瑞因组组间两两比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），表明AEAB的治疗效果与硫酸氨基葡萄糖和双醋瑞因相当。见表3～4。

表3　各组血清中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比较（μg/L，x±s）

表4　各组关节液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比较（μg/L，x±s）

3　讨论

目前OA的发病机制尚不十分明确，研究表明，软骨破坏以Ⅱ型胶原和蛋白多糖破坏丢失最明显［10］，而软骨基质中的主要成分Ⅱ型胶原对维持软骨的生物力学起决定性作用［11］。相关研究表明各种炎性因子在OA发病过程中起到重要作用［12］。近年研究提示MMPs对关节软骨细胞外基质的损伤是OA发病的“共同通路”［13-14］。MMP-3是MMPs的主要成员之一，其不仅能降解多种基质蛋白底物，更为重要的是MMP-3可激活MMP-1、MMP-9、MMP-13等酶原产生级联放大效应，加速软骨破坏［15］。IL-1β和TNF-α是已经被证实在OA的发病中起到重要介导作用的炎性因子［16-17］，具有抑制软骨合成、加快关节软骨降解的作用。

牛膝作为中药治疗OA中较为突出的一味，吸引了许多学者对其作用机制进行研究。本课题组前期实验表明，牛膝能增加兔关节软骨细胞增殖，提高软骨Ⅱ型胶原表达，促进骨髓源成体干细胞软骨分化［4-5］。李成付等［11］通过实验证实AEAB能降低软骨CKIP-1、Caspase-3蛋白表达，提高Bcl-2/Bax/Akt蛋白表达，从而促进软骨修复。

OA动物模型构建的方法有很多种，石膏固定制动制备OA模型，具有简单易行、无创伤、成功率高等特点，重要的是此法没有手术创伤的干扰，其病理改变更接近人类OA的发病过程［18］，适用于研究药物疗效及药物对关节软骨成分、炎症介质表达等方面的影响。

本研究发现，AEAB组软骨细胞数量及Ⅱ型胶原蛋白含量较模型组增多，Pelletier评分和改良Mankin评分明显降低，软骨基质结构纹理变整齐，同时发现AEAB能降低血清及关节液中MMP-3、IL-1β、TNF-α的含量，从而减轻其对关节软骨基质的损害，直接或间接改善软骨基质代谢，促进软骨修复，其效果和硫酸氨基葡萄糖及双醋瑞因无明显差异，说明AEAB与目前治疗OA的西药代表药物疗效相当，可为其临床使用提供参考及依据。但是，硫酸氨基葡萄糖与双醋瑞因存在胃肠道、过敏甚至心血管系统、外周水肿等不良反应［19-20］，而牛膝不但对OA有较好的治疗效果，而且根据现代药理研究［21］，牛膝还有增强免疫力、保肝、护肝、强心、抑制肿瘤转移等许多有益健康的作用，而其副作用目前尚无报道，因此本研究认为AEAB具有较高的临床应用价值，同时，其有效成分的筛选、中西药联合应用的疗效以及干预方式的优化等尚待进一步探索。

［1］杨旦红，穆怀典，黄俊武.硫酸氨基葡萄糖治疗膝骨关节炎的临床分析［J］.中国医药指南，2015，13（22）：112-113.

［2］黄进贤，张会昌，尹志华，等.双醋瑞因、硫酸氨基葡萄糖联合玻璃酸钠治疗膝骨关节炎的疗效［J］.实用医学杂志，2013，29（22）：3749-3751.

［3］陈浩雄，徐宁达，彭力平，等.中药治疗膝骨关节炎软骨修复实验研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2014，23（25）：2843-2845.

［4］彭力平，马笃军，林栋栋，等.牛膝醇提物体内诱导兔骨关节炎模型软骨修复的病理学观察［J］.湖南中医杂志，2013，29（2）：126-129.

［5］彭力平，马笃军，裴军宇，等.牛膝醇提物对急性软骨损伤兔软骨的影响［J］.中医杂志，2013，54（17）：1504-1506.

［6］国家药典委员会.中国药典［M］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

［7］曾俊华，马笃军，彭力平，等.实验兔膝骨关节炎模型的建立及鉴定［J］.中国临床研究，2016，29（5）：679-682.

［8］Pelletier JP，Jovanovic D，Fernandes JC，et al.Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase［J］. Arthritis Rheumatol，1998，41（7）：1275-1286.

［9］Mankin HJ，Dorfman H，Lippiello L，et al.Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips.Ⅱ.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data［J］.J Bone Joint Surg Am，1971，53（3）：523-537.

［10］张猛，周嘉俊，罗宗平.软骨损伤后Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达［J］.中国组织工程研究，2014，18（51）：8305-8309.

［11］李成付，王玖忠，边瑜健，等.牛膝醇提物促进兔骨关节炎软骨修复的作用及其机制的实验研究［J］.中国临床研究，2015，28（7）：844-847.

［12］郭伟雄，魏波.炎症细胞因子及通路在骨关节炎中的研究进展［J］.国际检验医学杂志，2015，36（15）：2240-2241.

［13］阳乐，许鹏.促炎细胞因子与骨关节炎［J］.中华骨与关节外科杂志，2015，8（5）：455-459.

［14］Pathak NN，Lingaraju MC，Balaganur V，et al.Anti-inflammatory and chondroprotective effects of atorvastatin in a cartilage explant model of osteoarthritis［J］.Inflammation Res，2015，64（3/4）：161-169.

［15］贺占坤，沈杰威.MMP-2、MMP-3、MMP-9和TIMP-1评价膝关节骨性关节炎的临床研究［J］.重庆医学，2013，42（32）：3872-3874.

［16］Ismail HM，Kazuhiro Y，Vincent TL，et al.Interleukin 1 acts via c-jun N-terminal kinase-2 signalling pathway to induce aggrecan degradation by human chondrocytes［J］. Arthritis Rheumatol，2015，67（7）：1826-1836.

［17］Osta B，Roux JP，Lavocat F，et al.Differential effects of IL-17A and TNF-α on osteoblastic differentiation of isolated synoviocytes and on bone explants from arthritis patients［J］.Front Immunol，2015，6：151.

［18］陈志达，林瀚洋，余志毅，等.膝骨关节炎动物模型研究进展［J］.风湿病与关节炎，2016，5（1）：67-70.

［19］邱贵兴，翁习生，张克，等.盐酸/硫酸氨基葡萄糖治疗骨关节炎的平行对照临床研究［J］.中华医学杂志，2005，85（43）：3067-3070.

［20］瞿雷.双醋瑞因治疗骨关节炎的多中心临床研究［J］.中外医学研究，2015，13（35）：40-41.

［21］田硕，苗明三.牛膝的化学、药理及应用特点探讨［J］.中医学报，2014，29（8）：1186-1188.

Effects comparison of alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix in the treatment of rabbits with osteoarthritis

CHEN DaLIAO ZhouweiMA DujunWANG LixinPEND Liping▲
Shenzhen Clinical Medical College Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangdong Province，Shenzhen518033，China

R684.3

A

1674-4721（2016）09（a）-0021-04

2016-05-02本文编辑：张瑜杰）

广东省深圳市卫生计生系统科研项目（医疗卫生类）（201501041）。