rhEPO对缺糖缺氧大鼠星形胶质细胞GLT-1和GLAST表达的影响

庞一强,杨　静,吴　刚,汪　静,姜树原,3

(1.包头市第四医院，内蒙古包头 014030；2.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头 014060；3.包头医学院中心实验室，内蒙古包头 014060)



rhEPO对缺糖缺氧大鼠星形胶质细胞GLT-1和GLAST表达的影响

庞一强1△,杨静2△*,吴刚2,汪静1,姜树原2,3

(1.包头市第四医院，内蒙古包头 014030；2.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头 014060；3.包头医学院中心实验室，内蒙古包头 014060)

为了研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对缺糖缺氧(OGD)培养大鼠星形胶质细胞GLT-1和GLAST表达的影响，将缺糖缺氧培养星形胶质细胞分成不同浓度rhEPO处理组：0、20、100 U/mL，不同浓度rhEPO与星形胶质细胞在缺氧缺糖条件下培养6 h，用RT-PCR 测定GLT-1和GLAST 的mRNA 表达变化，免疫印迹技术测定GLT-1和GLAST蛋白的表达变化。20、100 U/mL rhEPO星形胶质细胞GLT-1的mRNA和蛋白质水平较OGD对照组明显升高(P<0.05)，GLAST的mRNA和蛋白质水平变化不明显(P>0.05)。GLT-1水平可能与rhEPO对缺糖缺氧培养大鼠星形胶质细胞的保护作用有关。

重组人促红细胞生成素；星形胶质细胞；GLT-1；GLAST；缺糖缺氧

临床上各种原因导致的急性脑损伤日趋增多，尽管外源性损伤的原因很多，但这些因素均可以导致直接或间接的缺血性脑损伤，其中谷氨酸的神经毒在缺血性脑损伤的病理生理发展过程中起着十分重要的作用[1]。因此，对缺血期间谷氨酸水平的调控一直是脑缺血防治药物研究的重点。有研究表明，可以通过上调星形胶质细胞上谷氨酸转运体GLAST(EAAT1)和GLT-1(EAAT2)的表达或活性，增加缺血时谷氨酸的摄取，维持突触间隙内谷氨酸的正常浓度，从而降低兴奋性毒性，减轻缺血性脑损伤[2]。近年来，促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对缺血性脑损伤的神经保护作用日益受到人们的关注，其机制之一就是具有抗谷氨酸神经毒的作用[3]。本研究利用不同浓度的rhEPO与大鼠星形胶质细胞在缺糖缺氧条件下共培养，研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)在星形胶质细胞缺糖缺氧过程中对GLT-1和GLAST表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料

大鼠星形胶质细胞，CRL-2006 ATCC公司产品；DMEM(高糖)培养液，Hyclone公司产品；DMEM(无糖)培养液，钮因华信公司产品；连二亚硫酸钠，阿拉丁公司产品；rhEPO，上海凯茂生物医药有限公司产品；总RNA提取试剂盒，Biosharp公司产品；反转录试剂盒，Thermo Fisher公司产品；SYBR Premix EXTaq，宝生物工程 (大连)有限公司产品；兔源GLAST、GLT-1多克隆抗体、GADPH单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，Abcam 公司产品；BCA试剂，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；其余试剂均为国产试剂，由包头医学院生物化学与分子生物学实验室及中心实验室提供。

1.2方法

1.2.1大鼠星形胶质细胞的缺糖缺氧培养常规复苏大鼠星形胶质细胞，用DMEM(高糖)培养液培养至基本融合并铺满瓶底80%～90%后，将原培养液倒出，用PBS溶液清洗细胞3次，参照文献[4-5]在细胞中加入含10 mmol/L连二亚硫酸钠的DMEM无糖培养液一同转移置厌氧培养箱中(培养箱中充入体积分数为95%的氮气和5%的二氧化碳的混合气体)，进行 OGD 培养6 h。

1.2.2实时定量PCR检测rhEPO对大鼠星形胶质细胞OGD培养后细胞中GLT-1和GLAST mRNA水平的影响将星形胶质细胞接种于6孔细胞培养板中按照上述方法进行缺糖缺氧培养，并分为3个组，每组3个重复孔，分别为OGD对照组(OGD处理6 h)，rhEPO两个剂量组(终浓度分别为20、100 U/mL)。取出不同组3个孔的细胞，参照文献[6]进行胰酶消化细胞，用PBS溶液洗脱，1 700 r/min离心5 min，去上清，收集细胞。使用Trizol Reagent试剂盒抽提细胞总mRNA，并用DEPC水定量至5 μg/μL。用Prime Script One Step RT-PCR Kit将总mRNA拟转录成cDNA，并定量。以表1中引物进行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒和伯乐的IQ5 PCR系统扩增cDNA中的组织因子基因片段和GAPDH基因片段，每个样本设3个复孔。反应条件设置为：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s,共30个循环；最后72 ℃ 10 min，停止反应。计算每个样品TF和GAPDH的△Ct，并采用△△Ct法，计算每个样品中TF的mRNA转录倍数，用均数±标准差表示数值。

表1　试验用引物Table 1　Primers used in this study

1.2.3免疫印迹法检测rhEPO对大鼠星形胶质细胞OGD培养后细胞中GLT-1和GLAST 蛋白表达水平的影响取出不同组3个孔的细胞，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，1 700 r/min离心5 min，弃上清，用缓冲溶液重悬细胞至5×1010个。破碎后12 000 r/min离心20 min后取上清进行电泳。参照文献[7]用50 g/L浓缩胶和150 g/L分离胶进行电泳分离，并用电转仪将蛋白转至PVDF膜上。100 mL/L牛奶封闭PVDF膜1 h，37 ℃ 孵育一抗1 h， PBST清洗5 min×3，然后用37 ℃孵育二抗稀释液，PBST清洗5 min×3，每次5 min。最后用Amersham公司的 ECL试剂盒进行荧光显色反应，然后用3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并记录，用Image Pro PLUS软件分析目的蛋白/GAPDH的相对量，以均数±标准差表示数值。

1.2.4统计分析结果以均数±标准差表示，用SPSS17. 0数据统计软件应用方差分析对组间数据进行处理和分析，P<0.05 为有统计学意义。

2　结果

2.1GLAST、GLT-1 mRNA 的检测

由表2可以看出，GLAST mRNA表达在各组间未见有差异；GLT-1 mRNA表达 20、100 U/mL rhEPO组明显高于OGD对照组，且100 U/mL rhEPO组高于20 U/mL rhEPO组(P<0.05)，表明当大鼠星形胶质细胞进行OGD培养时，加入rhEPO可明显增强GLT-1 mRNA的表达量，且呈现浓度依赖关系；但对GLAST mRNA表达的影响不明显。

表2　不同浓度rhEPO作用于OGD大鼠星形胶质细胞 GLAST、GLT-1 mRNA表达的变化Table 2　The changes of mRNA of GLT-1 and GLAST in rat astrocytes cultured with different concentrations of rhEPO by oxygen-glucose deprivation(△△Ct, GAPDH as control，n = 3)

注：与OGD对照比较，*P<0.05;与20 U/mL rhEPO比较，#P<0.05。

Note:Compared with OGD control group,*P<0.05;compared with 20 U/mL rhEPO group,#P<0.05.

2.2GLAST、GLT-1蛋白的检测

图1A为免疫印迹法检测GLAST、GLT-1蛋白的电泳结果，图1B和图1C为GLAST、GLT-1蛋白表达的相对量。由图1C 可知，GLAST 蛋白质表达在各不同浓度rhEPO组间未见有差异；而GLT-1蛋白质表达20、100 U/mL rhEPO 组显著高于OGD对照组，且100 U/mL rhEPO组高于20 U/mL rhEPO组(P<0.05)(图1 B)，说明当大鼠星形胶质细胞进行OGD培养时，加入rhEPO 可明显增强GLT-1蛋白的表达量，且呈现浓度依赖关系；但对GLAST蛋白表达的影响不明显。

3　讨论

EPO是骨髓中血红细胞前驱的细胞因子，是由166个氨基酸组成的酸性糖蛋白，分子质量为34 ku，是一种刺激机体造血器官、促进红细胞生成的糖蛋白类激素。EPO与其受体广泛存在于人和动物体内的组织和器官中，并且在神经元及神经胶质细胞中均有表达。近年来，EPO 由于具有促进中枢神经系统的生长发育及神经保护作用，而在中枢神经系统中的影响备受关注[8]。其中，唐兆华[9]通过试验，证实了C-EPO预处理能明显减轻体外氧糖剥夺/复氧损伤引起的星形胶质细胞水肿；侯丽淳等[10]研究发现，EPO能够降低大鼠脑出血模型中大鼠脑内谷氨酸的含量，减轻脑水肿，减少大鼠周边组织神经细胞的凋亡；Yu D等[11]研究发现，EPO通过上调GLT-1和GLAST的表达而发挥对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。说明EPO可以通过上调GLT-1和GLAST的表达、减轻兴奋性神经递质毒性作用、减轻星形胶质细胞水肿等机制从而发挥神经保护作用。

与OGD对照比较，*P<0.05;与20 U/mL rhEPO比较，#P<0.05

Compared with OGD control group,*P<0.05;compared with 20 U/mL rhEPO group,#P<0.05

A.Western blot;B.GLT-1;C.GLAST

1.OGD;2.20 U/mL rhEPO;3.100 U/mL rhEPO

图1免疫印迹分析GLAST、GLT-1在大鼠星形胶质细胞中的表达

Fig.1Western blot analysis of GLAST and GLT-1 expressions in astrocytes of rats

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统重要的兴奋性神经递质[12]。在脑缺血时谷氨酸的兴奋性毒性作用会对脑组织造成严重的病理性损害。突触间隙谷氨酸的清除主要依靠神经元和神经胶质细胞的兴奋性谷氨酸转运体(excitatory amino acid transporters，EAATs)又称高亲和力谷氨酸转运体快速去除[13]。真核生物兴奋性谷氨酸转运体分为GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5个亚型。GLAST和 GLT-1主要表达在神经胶质细胞上，其中GLAST在小脑分子层的 Bergmann神经胶质细胞含量最为丰富，在脊髓、前脑以及内耳、视网膜等处也有少量表达 。GLT-1在中枢神经分布广泛，主要位于前脑、大脑皮质、海马等部位的星形胶质细胞膜上，同时也表达在发育阶段的神经元上，GLT-1负责清除大约90%的谷氨酸[14]。GLT-1是众多药物发挥星形胶质细胞保护作用的靶点，如余鹏[15]通过试验发现，补阳还五汤可以提高星形胶质细胞GLT-1的表达，降低细胞外液谷氨酸浓度，减轻细胞损伤，从而对星形胶质细胞起到保护作用；王洁[16]则发现腺苷预处理可降低OGD后星形胶质细胞的损伤程度，并使OGD后GLT-1的表达水平升高，从而增强了大脑对缺血再灌注损伤的耐受。在本研究中，在加入rhEPO后可明显上调缺糖缺氧大鼠星形胶质细胞GLT-1的表达，可能是通过GLT-1清除细胞外液谷氨酸而减轻缺血缺氧引起的谷氨酸的兴奋性毒性作用，从而对缺糖缺氧培养大鼠星形胶质细胞起到保护作用。而要明确rhEPO通过何种途径改变GLT-1的表达还需进一步的研究。

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Effects of rhEPO on Expressions of GLT-1 and GLAST in Rat Astrocyte of Cultured by Oxygen-glucose Deprivation

PANG Yi-qiang1,YANG Jing2,WU Gang2,WANG Jing1,JIANG Shu-yuan2,3

(1.TheFourthHospitalofBaotou,Baotou,InnerMongolia,014030,China;2.DepartmentofBasicMedicineandForensicMedicine,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China;3.CentralLaboratory,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China)

In order to study effects of rhEPO on the expressions of GLT-1 and GLAST in rat astrocytes cultured by oxygen-glucose deprivation,the astrocytes of rats cultured by oxygen-glucose deprivation were divided into three groups with different concentrations of rhEPO 0, 20, 100 U/mL and cultured for 6 hours by hypoxia-glucose deprivation.The real-time PCR and Western blot were used to detect the changes of mRNA and protein expressions of GLT-1 and GLAST,respectively.In comparison with OGD control,mRNA and protein levels of GLT-1 were found to be increased in the groups of 20 and 100 U/mL rhEPO (P<0.05),but the changes of GLAST were not obvious(P>0.05).The changes of GLT-1 may be related to protective effects of rhEPO on astrocytes of rats cultured by oxygen-glucose deprivation.

rhEPO; astrocyte; GLT-1; GLAST; oxygen-glucose deprivation

2016-02-24

内蒙古自治区自然科学基金项目(2013MS1111);包头市医药卫生科技计划项目(Wsjj2015016)

庞一强(1978-)，男，内蒙古包头人，主治医师，硕士，主要从事神经外科学研究。△同等贡献作者。*通讯作者

S852.23

A

1007-5038(2016)10-0081-04