山西省鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定

孟冬霞，宇文延青，武果桃，任　杰，曹水清，赵　娟，孟　帆，刘一飞，马政禹

(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原 030032；2.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007；3.阳泉市农业委员会，山西阳泉 045000；4.山西农业大学，山西太谷 030801)



山西省鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定

孟冬霞1，宇文延青2*，武果桃1，任杰1，曹水清3，赵娟1，孟帆1，刘一飞1，马政禹4

(1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原 030032；2.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007；3.阳泉市农业委员会，山西阳泉 045000；4.山西农业大学，山西太谷 030801)

为了解山西省鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)流行毒株的遗传变异规律，将近5年来采集自山西不同地区发病鸡群的法氏囊组织病料，通过接种易感雏鸡分离出15株IBDV。用绒毛尿囊膜接种法测定鸡胚半数致死量，其ELD50在10-2.18～10-2.91；测定所有分离株对非免疫鸡的致死率，结果为63.3%～86.7%，属于超强毒株；利用RT-PCR扩增病毒VP2基因并进行序列分析。结果表明，所分离的15株病毒均具有传染性法氏囊病病毒超强毒株的主要分子特征，即222A(WS2为S)、249Q、254G、256I、279D、284A、294I、299S及七肽区SWSASGS，综合其对非免疫鸡的致死率，确认所有分离毒株属于超强毒病毒株。说明在山西省境内存在传染性法氏囊病病毒超强毒株。

传染性法氏囊病病毒；流行毒株；分离鉴定

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseas virus，IBDV)是传染性法氏囊病(Infectious bursal diseas，IBD)的病原，属双RNA病毒科(Birnaviridae)的成员，基因组包括A、B两个节段，共编码VP1、VP2、VP3、VP4、VP5等5种蛋白，其中VP2为主要结构蛋白，约占病毒总蛋白的51%，是重要的毒力基因，VP2高变区(206-350位)一些位点氨基酸残基突变与病毒抗原和毒力变异有关[1-4]。目前IBDV标准毒株、超强毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)及变异株在中国并存，致使免疫接种过疫苗的鸡群经常发病，加剧了传染性法氏囊病的防控难度[5-9]。分离鉴定地方流行毒株，有助于合理使用疫苗、研制新型疫苗和建立有效的防控措施。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料于2008年—2012年从山西省不同地区发病鸡场采集疑似IBD病鸡的法氏囊，冻存后带回实验室备用，相关资料见表1。

1.1.2鸡胚及易感雏鸡SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，在实验室中孵化至使用；21日龄非免疫鸡，由太谷某养殖户提供。

1.1.3试剂SuperscriptTMRT-PCR Systems试剂盒，Invitrogen公司产品；ExTaq、RNAiso Plus、dNTP，宝生物工程(大连)有限公司产品；M-MLV逆转录酶、pMD18-T，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；FITC标记兔抗鼠荧光二抗，Sigma公司产品。其他所用试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1病毒分离所有病料均按OIE手册中《诊断试验与疫苗》标准方法进行处理。病毒分离按欧盟关于IBDV分离的标准方法进行，即取病毒悬液经滴鼻或点眼接种3周龄非免疫雏鸡(0.1 mL/只)，接种后4 d，处死，收集病变法氏囊，按OIE标准方法处理后，置-70℃冻存备用。另外一部分法氏囊用于IBDV的荧光检测，同时采集濒死鸡法氏囊、盲肠扁桃体和胸腺制备病理切片。

1.2.2病毒RT-PCR鉴定根据GenBank提供的日本OKYM株A节段VP2基因序列(登录号为D49706)设计用于扩增分离毒株VP2基因ORF全长的特异性引物：上游引物(P1)，5′-ggGAATTCatgacgaacctgcaagat-3′ ；下游引物(P2)，5′-gcGTCGACccggattatgtctttgaag-3′，大写字母为加入的酶切位点，P1在5′端加入EcoR Ⅰ，P2在5′端加入SalⅠ，引物由Invitrogen公司合成。病毒RNA提取根据RNAiso Plus试剂盒说明书进行。第1链cDNA合成按M-MLV试剂盒说明书进行，为增强PCR特异性，在反转录产物加入1 μL(2 U)RNaseH，37℃水浴20 min。PCR扩增体系为100 μL：模板5 μL ，10 × Ex buffer 10 μL，dNTP(2.5 pmol/L)8 μL，上游引物P1(10 pmol/L)1 μL, 下游引物P2 (10 pmol/L) 1 μL，ExTaq1.5 μL, 补ddH2O至100 μL；PCR扩增条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 2 min,35个循环；72℃ 10 min，4℃结束反应。扩增产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。回收各目的条带连接至pMD18-T载体上，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，摇菌，提取质粒进行PCR鉴定，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1　病料及病毒相关资料Table 1　The information of samples and isolated strains

注：“L”蛋鸡；“B”肉鸡;“ZZ”长子；“WS”文水；“TY”太原；“TG”太谷；“YQ”阳泉。

Note: "L"Layer;"B"Broiler;"ZZ"Zhangzi;"WS"Wenshui;"TY"Taiyuan;"TG"Taigu;"YQ"Yangquan.

1.2.3鸡胚半数致死量(ELD50)的测定用灭菌PBS分别将分离株病毒悬液10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4等4个不同稀释度，每个稀释度经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)途径接种8日龄SPF鸡胚10枚(0.1 mL/枚)，37℃孵化，剔除24 h内死亡鸡胚，观察至144 h，记录鸡胚死亡情况及胚体病变，最后根据Reed-Muench法计算分离病毒的ELD50。同时设阴性对照组。

1.2.4病毒致病性试验每组10只3周龄非免疫鸡，经滴鼻、点眼攻毒，剂量为10×ELD50/0.1 mL，同时设阴性对照，每组3个重复，记录死亡情况，并计算平均致死率。

1.2.5组织学病变将采集的法氏囊、盲肠扁桃体和胸腺，用100 mL/L的中性福尔马林溶液固定制作病理切片，观察病理变化。

1.2.6序列分析将所得的15个地方株目的基因序列与GenBank中14个参考株比较(表2)。利用DNA Star 5.01对VP2基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性进行比较和变异分析。用MEGA5.5对29个序列的推导氨基酸序列进行遗传进化分析(NJ法、bootstrap为1 000次)。

注：SⅡ.血清Ⅱ型；.CS.经典毒株；AS.弱毒株；VS.变异毒株；VVS.超强毒株。

Note:SⅡ.Serotype Ⅱ;CS.Classical strain;AS.Attenuated strain;VS.Variant strain;VVS.Very virulent strain.

2　结果

2.1病毒的致病性

非免疫鸡接种15株分离株后，全部出现精神沉郁，呆立不动，拉白色稀粪等临床症状，3 d～4 d出现死亡高峰。剖检死鸡可见法氏囊肿胀、水肿、出血，呈“紫葡萄样”外观，腿肌出血，肾呈“花斑样”，腺胃与肌胃交界处有斑块状出血。死亡率为63.3%～86.7%(表1)，根据国际毒力标准判定为超强毒株。

2.2组织学病变

病鸡法氏囊内淋巴细胞坏死崩解呈空泡状，有出血或淤血。盲肠扁桃体内淋巴小结淋巴细胞坏死，出血，肠黏膜脱落。胸腺内淋巴细胞有少量坏死崩解，出血。对照组无明显病理变化(图1)。

1～3.对照组；4～6.发病鸡；1、4.法氏囊；2、5.胸腺；3、6.盲肠扁桃体

1-3.Control groups;4-6.Test groups;1,4.Bursa;2,5.Thymus;3,6.Cecum tonsi

图1组织病理学变化(HE,100 ×)

Fig.1Histopathological lesions caused by IBDVs(HE,100 ×)

2.3鸡胚半数致死量测定

IBDV悬液经CAM途径接种鸡胚后，试验组与对照组鸡胚相比，出现胚体出血，头部水肿。根据鸡胚死亡情况，利用Recd-Muench法计算出每0.1 mL病毒的ELD50为10-2.81～10-2.18(表1)。

2.4VP2基因扩增结果

提取的各分离株的RNA经RT-PCR扩增后均获得长度约1 320 bp左右的扩增产物，与预期大小相符，电泳图及质粒鉴定图略。

2.5分离株VP2基因序列分析

用RT-PCR对分离株的VP2全基因进行扩增、测序和序列分析。测序分析结果表明，IBDV VP2全长为1 323 bp，与预期产物大小相符，编码441个氨基酸。核苷酸与氨基酸序列同源性分析显示，二者均与vvIBDV参考株UK661株同源性较高，核苷酸序列同源性为97.5%～99.4%，氨基酸序列同源性为99.1%～100%(图2)。高变区氨基酸：222A(WS2为S)、249Q、254G、256I、279D、284A、294I和299S，七肽区为SWSASGS，符合vvIBDV VP2蛋白的分子生物学特征(图3)。遗传进化分析表明，所有分离毒株与来源于其他国家或地区的vvIBDV聚为一群，Bootstrap值达79%(图4)。

3　讨论

自从1957年首次在美国发现IBD以来，该病迅速蔓延至世界各地，对各国养禽业造成严重威胁。随着疫苗的使用，该病一度得到较好的控制，但20世纪80年代末变异毒株和vvIBDV的出现，使该病的控制面临着严峻考验[10]。

根据目前发表的文献资料，vvIBDV毒株VP2蛋白高变区氨基酸具有以下特征：七肽区(326-332)氨基酸序列为SASWSGS，279位和284位氨基酸分别为D和A，这是毒力的必要条件；222A、256I、294I和299S可使病毒局部亲水性增加，使毒力增强[2,11-12]。一般认为vvIBDV对SPF鸡的致死率均超过60%，但Jackwood D J等[13-14]认为，IBDV的最终判定应根据临床症状、致病性并结合分子生物学方法进行。本文收集2008年—2012年期间山西省不同地区疑似患IBD病鸡法氏囊病料75份，根据OIE标准分离出15株IBDV毒株，测定了病毒毒力。病理学检测发现病鸡法氏囊内淋巴细胞坏死崩解，呈空泡状，有出血或淤血；盲肠扁桃体内淋巴小结淋巴细胞坏死，出血，肠黏膜脱落；胸腺内淋巴细胞有少量坏死崩解，出血，属于IBDV感染引起的典型病变。VP2蛋白序列分析发现，除TY-3(279N)、TY-2(284T)、WS-2(222S)和ZZ-3(294V)4株外，其余11株具vvIBDV分子特征，即222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I、299S及七肽区SWSASGS，相似率达100%[5,7,9,11]，所有毒株对非免疫鸡的致死率均大于60%，根据vvIBDV的判定标准所有分离毒株应属于vvIBDV。因此，仅根据分子特征判定IBDV是否为超强毒株并不一定准确，还应结合致死率判定。

A.核苷酸序列同源性比较；B.氨基酸序列同源性比较

A.Homology analysis of nucleotide sequences;B.Homology analysis of amino acid sequences

图2分离毒株与UK661序列同源性比较

Fig.2Comparison of the homology between isolated strains and UK661

图3　分离毒株与UK661 VP2高变区比较

图4　分离毒株的遗传进化分析

总之，2008年—2012年流行于山西部分地区的IBDV可能以超强毒株为主，但其主要结构蛋白VP2的高变区域、关键毒力位点并没有发生太大变异，之所以还有IBD的发生可能与疫苗的贮藏、使用方法及管理有关。因此，在鸡传染性法氏囊病防控方面除加强对病原的监控外，还应加强对相关疫苗的管理和规范使用。

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�毒株资料 Table 2Information of

名称Strains毒株类型Type登录号Accessionnumbers来源Origions23-82SⅡAF362773美国USASerotype2SⅡU30818加拿大CanadaCJ801CSAF006701中国ChinaF52/70CSD00869法国FranceGtASAY368653中国ChinaD78ASAF499929荷兰NetherlandEvariantVSAF133904美国USAUK661VVSX92760英国EnglandSH95VVSAY134874中国上海ShanghaiChinaSD-2VVSEU042147中国山东ShandongChinaGxVVSAY444873中国广西GuangxiChinaHKVVSAF092943中国香港HongkongChinaYN-hVVSEU328335中国云南YunnanChinaHarbin-1VVSAF454945中国黑龙江HeilongjiangChina

Isolation and Identification of Chicken Infectious Bursal Disease Virus Strains In Shanxi Province

MENG Dong-xia1,YUWEN Yan-qing2, WU Guo-tao1, REN Jie1,CAO Shui-qing3，ZHAO Juan1,MENG Fan1, LIU Yi-fei1, MA Zheng-yu4

(1.AnimalHusbandryandVeterinaryInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan,Shanxi,030032,China;2.LifeandScienceCollege,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan,457003,China;3.CommissionofAgricultureofYangquanCity,Yangquan,Shanxi,045000,China;4.ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi,030801,China)

In order to investigate the genetic variation of chicken infectious bursal disease virus in Shanxi province,15 IBDV strains were isolated by inoculating susceptible chickens with the supernatant of homogenized epidemic materials from bursae,which were collected from the onset chickens in different areas of Shanxi nearly five years.Median lethal dose were determined by embryo allantois membrane inoculation method,and its ELD50within 10-2.18-10-2.91.The fatality rate of all isolates to the experimental chickens were determined,the results showed that the fatality rate of all isolates were 63.3%-86.7%,the criteria for the very virulent IBDV (vvIBDV).The VP2 genes of isolates were amplificated by RT-PCR and sequenced, the sequence analysis showed that the 15 isolates had molecular characteristics of vvIBDV-222A(WS2 S),249Q,254G,256I,279D,284A,294I,299S and the conserved seven peptide domains of SWSASGS.All results suggested that the isolats belong to the vvIBDV group.

Infectious bursal disease virus;epidemic strains;isolation and identification

2016-04-05

山西省国际科技合作项目(2012081012)

孟冬霞(1968-)，女，山西翼城人，主要从事中兽医药及动物疾病防治研究。*通讯作者

S852.659.4

A

1007-5038(2016)10-0070-05