油葵嫁接及其在离体培养和转基因中的应用

焦展　安胜军　邵铁梅

摘要：以油葵为试材，用实生苗砧木和接穗进行嫁接试验，比较斜接、插接、劈接和合接4种方法以及不同品种、苗龄的砧木、嫁接后绑缚方法的嫁接效果，并试验离体培养的转基因接穗嫁接效果。结果表明，劈接法最为适宜，砧木选用在1对真叶期和2对真叶期的恢复系嫁接效果较好；嫁接后用棉线绳绑缚，湿报纸包裹，最后用嫁接夹固定，实生嫁接成活率可达80%以上。采用子叶节侵染和去1片子叶侵染2种转基因方法，获得转基因阳性接穗经壮苗培养后嫁接，得到完整植株的成活率可达60%和81.11%，明显高于用生根移栽的方法和直接嫁接的方法，而且嫁接植株能够正常开花结籽。从结果可以看出，劈接法为油葵最适宜的嫁接方法，可显著提高离体培养和转基因研究中获得完整植株的概率，且能够应用于油葵基因工程育种研究中。

关键词：油葵；嫁接；劈接法；离体培养；转基因

中图分类号： S565.504.3；S339.4+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0143-04

嫁接技术是一门应用广泛的园艺技术，也是近年来基因工程育种研究领域的常用技术之一[1-2]。油葵即油用向日葵（Helianthus annuus L.），是我国乃至世界重要的油料作物。向日葵离体培养和转基因方面的研究已有几十年的历程[3]。通过基因转化将有益基因导入作物是抗病、抗虫和抗逆育种的有效手段，同时也是转基因植物生产药用蛋白不可缺少的重要基础[4-6]。然而，多年来在向日葵离体培养和转基因研究中发现，油葵离体培养和遗传转化研究中常遇到诸如离体生根困难，移栽成活率低，再生或转化植株易早花败育、结实困难等问题[7-8]。这些问题已成为该植物转基因研究中获得完整植株并繁育后代的严重障碍[3]。已有研究指出，利用嫁接可获得完整转基因植株[4，9-13]。但是关于油葵嫁接的具体技术方面的研究还未见报道。本试验详述了一种油葵嫁接新技术，可有效解决这一难题，为油葵离体培养转基因研究中获得完整植株开辟了新的途径。同时，该技术也适用于其他栽培研究方面，能够为向日葵远缘杂交、品种改良等研究提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 本试验以罗马尼亚“精选”恢复系为试材，进行离体培养和转基因技术研究。在嫁接试验中砧木选用罗马尼亚“精选”恢复系（种子由河北省半干旱研究中心提供）和杂交种“矮大头”（从种子公司购买），接穗选用 “精选”恢复系及其离体培养材料。

1.1.2 培养基 种子萌发培养基MS+0.1 mg/L 6-BA，去1片子叶离体培养基：MS+0.1 mg/L 6-BA。子叶节再生培养基MS+B5有机物+肌醇0.1 g/L+KNO3 5 g/L+水解酪蛋白0.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.07 mg/L+TIBA 0.02 mg/L+苯丙氨酸5.0 mg/L+AgNO3 7.0 mg/L。培养基中含蔗糖30 g/L，琼脂7.0 g/L，pH值5.8。

1.1.3 试剂 所用试剂购自上海生工公司；培养土为北京大汉公司培养土，与蛭石1 ∶ 1混合。

1.2 方法

1.2.1 油葵的离体培养和转基因 油葵去1片子叶再生和转化：油葵种子消毒后，放于培养基中萌发3～4 d，用解剖刀去掉1片子叶并划伤生长点部位。将制备好的外植体放于预先制备好的农杆菌（含有胰岛素基因）悬菌液中浸泡0.5～1 h，共培养3 d。然后转入含卡那霉素（Kan） 50 mg/L和头孢霉素（Cef） 250 mg/L筛选培养基中筛选3周得到抗性芽，每周更换1次培养基。最后取叶片经PCR检测，结果为阳性的抗性芽用于嫁接。

油葵子叶节的离体再生和转化：油葵种子消毒后，置于无菌瓶中，摇床振荡培养6 h（135 r/min，27 ℃）。在超净工作台上用解剖刀将种子2片子叶分开，适当去除1 mm左右胚轴，并确保去除生长点和幼芽，最后切除子叶远离生长点的1/2部分，剩余部分作为离体再生的外植体。侵染方法同上。侵染后3 d转入含Cef 250 mg/L的再生培养基中生长10 d，然后转入含Kan 50 mg/L 和Cef 250 mg/L筛选培养基中筛选3周，每周更换1次培养基。最后将得到的抗性芽取叶片作PCR检测，结果为阳性的用于嫁接。

转基因方法由农杆菌介导，使用的菌株为含有胰岛素基因的LBA4404。PCR检测所用引物序列为：上游引物5′-CGGGGTACCTCGTCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′；下游引物5′-CGAGCTCTTAGTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。

1.2.2 接穗和砧木的选择 接穗的准备方法：挑选健壮种子播种，待幼苗长至1对真叶时取上胚轴以上部位作为接穗供嫁接使用。离体培养的再生芽和转基因试验中的阳性芽也作为接穗使用。

砧木的准备方法：将油葵种子（品种为罗马尼亚“精选”恢复系和杂交种“矮大头）用湿播法播种于10 cm营养钵里，每穴1株。用子叶期至2对真叶期的幼苗在子叶节处、上胚轴处或1对真叶和2对真叶的茎节之间切去上半部位丢弃，余下部分作为砧木。

1.2.3 嫁接方法的比较 本试验比较4种嫁接方法（图1），砧木切割部位均为第1对真叶以上2.0～3.0 cm处，并将以上部位除去，4种嫁接方法分别为：（1）斜接法，挑选茎粗相近的接穗和砧木，在接穗的下端和砧木的上端均斜向削出 10 cm 左右等长的平整斜面，将两斜面对接整齐。（2）插接法，取尖锐竹签从砧木横截面上插孔，将接穗下端削成适合砧木凹槽和深度的形状，插入砧木孔中。（3）劈接法，用锋利刀片于砧木茎中间竖直劈开1.0 cm左右的切口；在接穗下端削出两面各1.0 cm长的斜面，将接穗插入切开的砧木，使二者的形成层部分对齐。（4）合接法[14]，自上而下将砧木的茎削成平滑的斜面，斜面长度为 1.0～1.5 cm，自斜面顺茎中轴垂直将茎切开至斜面底部，切口深度0.5～1.0 cm。将接穗削成与砧木同样大小的斜面并沿中轴垂直切开，刀口深度 0.5～1.0 cm。将砧木和接穗内切面部位的茎相互交错插至切面底部。统计嫁接后5、10 d成活率，每种嫁接方法试验30株，重复3次。

1.2.4 砧木不同苗龄和不同品种的比较 砧木不同品种和苗龄的试验采用6个处理，分别为子叶期恢复系、1对真叶期恢复系、2对真叶期恢复系、子叶期“矮大头”、1对真叶期“矮大头”和2对真叶期“矮大头”。接穗均为恢复系实生植株的1对真叶期的顶芽。每处理30株，重复3次，嫁接后10 d统计成活率。

1.2.5 嫁接绑缚和嫁接后的管理 嫁接绑缚的4种方法相比较：（1）用棉线绳绑缚接口，并用保鲜膜保湿；（2）用湿报纸包裹接口并用嫁接夹固定；（3）用湿报纸包裹接口并用棉线绳绑缚固定；（4）用湿报纸包裹、棉线绳绑缚，最后用嫁接夹固定。每处理30株，重复3次。嫁接后，用保鲜袋覆盖植株，并保证每天开袋透气2次，每次10 min左右，并喷水保湿。5 d 后拆除绑缚和嫁接夹，但仍需注意保湿，循序渐进摘除保湿袋，7～10 d后检查嫁接成活。14 d后将嫁接成活株移至大盆。

1.3 数据统计分析

嫁接后5～10 d观察伤口愈合情况和生长状态，统计嫁接苗成活率，计算平均值。数据用DPS进行统计分析，方法为邓肯氏新复极差法，显著水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同嫁接方法的嫁接效果

本试验为更科学地比较4种嫁接方法的优劣，用“精选”恢复系实生苗接穗进行嫁接试验。嫁接后5 d成活率分别为：斜接法和劈接法成活率较高，分别为84.44%和88.89%，而插接法和合接法成活率较低，分别为60.00%和62.22%。而嫁接后10 d统计数据显示劈接法成活率最高（82.22%），是油葵嫁接最理想的方法，其次为斜接法62.22%，而插接法和合接法成活率较低，分别为33.33%和37.78%（图2）。通过与非嫁接苗的生长状况进行比较，嫁接后10 d，嫁接苗长势明显偏弱，生长速度缓慢，但经过20 d左右的生长，砧木和接穗结合良好后，嫁接苗会迅速生长，最终与非嫁接苗相比，茎肝略细，花盘略小，可正常结实，籽粒饱满。

2.2 砧木品种和苗龄对嫁接的影响

本嫁接试验用“精选”恢复系作为接穗，比较了同品种砧木和杂交种“矮大头”2种砧木对嫁接的影响。结果表明，“精选”恢复系的嫁接成活率明显高于“矮大头”的嫁接成活

率，说明砧木“矮大头”与接穗的亲和力较差。而比较不同苗龄对嫁接的影响，1对真叶期和2对真叶期的恢复系砧木嫁接效果最好，成活率均高于80%，且两者没有显著性差异。因此，本研究中其他试验均选用1对至2对真叶期的恢复系实生苗作为嫁接砧木使用（图3）。

2.3 绑缚方法对嫁接成活率的影响

试验结果表明，用棉线绳绑缚并用保鲜膜保湿的方法在4种方法中成活率最低，仅为11.11%；而报纸保湿并用嫁接夹固定和报纸保湿用棉线绳固定2种方法的成活率没有显著性差异，分别为38.89%和42.22%；成活率最高的绑缚方法为，用棉线绳绑缚，然后用报纸保湿最后用嫁接夹再次固定。这种方法嫁接成活率显著高于其他方法，成活率为84.44%（图4）。

2.4 离体培养再生苗或转基因苗的嫁接

2.4.1 离体培养再生芽或转基因芽的获得 侵染后的子叶节外植体3～5 d开始吸水膨胀，10 d左右可用肉眼观察到在子叶节处有膨胀的芽点。多数情况下芽点出现在子叶节处，后期分化出再生芽。去1片子叶实生株经农杆菌侵染后，10 d 后也可见新的幼芽萌发。通过2种方法，并经过3次抗生素筛选，均可得到抗性芽，PCR结果如图5所示。将阳性芽作为接穗嫁接于砧木上，成活后即可初步得到完整的转基因植株。

2.4.2 离体培养转基因芽的嫁接 预试验研究中发现，通过子叶节和去1片子叶的转化方法，获得转基因芽后进行生根移栽以期获得完整植株，成活率相当低（10%和17.78%）。即使获得完整植株，植株瘦弱，早花现象严重，几乎不能获得种子。依靠嫁接技术获得完整植株，成活率可达40%和 56.67%。而嫁接前，对接穗进行壮苗培养，将转基因阳性芽移至不含Kan的培养基中，并在培养基中添加少量的PP333，培养7 d，然后开瓶锻炼3 d。结果表明，经壮苗培养的接穗嫁接成活率明显高于直接嫁接的接穗，成活率可达60%和 81.11%（图6）。

由子叶节和去1片子叶2种方法转化得到的转基因芽，经过壮苗培养和开瓶锻炼，作为接穗，采用劈接法嫁接于实生苗砧木，10 d后接口愈合良好，20 d后茎秆变粗生长迅速，35 d 后可开花，最终能够获得种子（图7）。

3 讨论与结论

本试验系统研究了油葵嫁接技术，并将其应用于转基因研究中获得了完整的转基因植株，并能够开花结籽。嫁接技术能够提高离体培养转基因苗的成活率，这和前人研究结果[15-16]一致。研究结果显示，劈接法为油葵最适宜的嫁接方法。这与王彦霞等、吴慎杰等在棉花上的结果[14，16]不同。原因可能与植物本身生长特性和生理状态相关。棉花幼苗的茎

较粗较硬，而油葵幼苗的茎较为纤细柔嫩，因此，适宜棉花的合接法对于油葵来说，操作不便，操作过程过长会造成茎的失水萎蔫，不利于接口愈合。而劈接法操作简便，且更为直观，容易使接口形成层对准，因而更利于接口愈合[17-18]。但有研究指出，嫁接成活后砧木和接穗可能会相互影响，还有可能发生遗传物质的转移[1，19-20]，本研究未做探讨，有待进一步深入研究。

需要注意的是，在嫁接伤口愈合前，砧木和接穗都靠自身的养分积累提供营养物质[1，19]。因此，砧木和接穗在嫁接前需要去除多余的叶片，以减少养分的消耗。研究中比较了4种不同的嫁接后绑缚方式。棉线绳、保鲜膜和嫁接夹都具有一定的固定功能，保鲜膜和报纸则用来对接口进行保湿。保鲜膜保湿效果较好，但容易造成接口处通气不良，接口易坏死。而棉线绳绑缚并用湿报纸保湿，既能起到良好地固定作用使接口较好的接合，又能使接口处于湿润状态，由于每天喷水并开袋透气，所以保湿效果良好，接口愈合快。另外，嫁接夹不可过紧，否则影响接口养分运输，造成结合不良。嫁接时可将嫁接夹的环放松一点，以能够固定嫁接绑缚物并且茎秆接口处不变形为准，可达到良好的效果。

该嫁接技术可显著提高离体培养和转基因研究中获得完整植株的概率，且嫁接后的转基因植株能够正常开花结实。该方法可应用于油葵基因工程育种研究中。

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