磷脂酶D及其产物磷脂酸的调控和功能研究进展

张军林　郭晓红　谢立兰

摘要：磷脂酶D是广泛存在于动植物各种组织和细胞中的一类磷酸二酯酶，自身及其代谢产物磷脂酸可以调控细胞内许多生理生化活动，例如细胞内囊泡运输、细胞表面受体的信号传导和细胞骨架蛋白重组等。本文主要讨论哺乳动物磷脂酶D家族的分子生物学特点，及其代谢产物磷脂酸在磷脂酶D调控细胞生理和代谢性疾病上所发挥的重要作用。

关键词：磷脂酶D；磷脂酸；细胞调控；囊泡融合

中图分类号： Q556 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0015-04

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）最先是在胡萝卜提取物中发现的，具有磷酸二酯酶的活性，可以专一地水解卵磷脂产生脂质第二信使磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和胆碱。PLD超家族成员广泛存在于病毒、细菌、酵母菌、植物及动物体中。在哺乳动物细胞中，除白细胞和少数淋巴细胞外，均有PLD活性存在。20世纪90年代，研究人员克隆了PLD基因，发现PLD的活性及其代谢产物对动物的生理过程和某些疾病发生产生影响，如炎症、糖尿病、细胞骨架重建、囊泡运输和胞外分泌、肿瘤形成，以及嗜中性粒细胞氧化呼吸链的阻断等。这些发现均来自于PLD的磷酸基团转移作用，即在有水或一级醇（如乙醇、丁-1-醇）存在时，PLD能催化水解卵磷脂产生PA和磷脂酰乙醇或磷脂酰丁-1-醇。PA作为PLD在细胞中的主要代谢产物，在细胞内受到严格的调控。PA还可以被转化成为另外2个具有生物活性的脂质分子，甘油二酯（diacylglycerol，DAG）和溶血磷脂酸（phosphatidicacid，LPA）。PA与这2个活性分子参与细胞中骨架蛋白重建、囊泡运输和受体信号传导等重要生理过程。本文主要讨论哺乳动物PLD代谢的前体和产物，尤其是磷脂酸在PLD功能发挥中的作用。

1 磷脂酶D家族分子生物学特点

从植物、细菌和哺乳动物中克隆的磷脂酶D组成一个基因家族，具有一系列高度保守序列和特征，这个基因家族包括细菌PLD、磷酸转移酶/磷脂合成酶、核酸内切酶和一些病毒外壳结构蛋白。目前对动物体中对PLD1、PLD2的研究较多，主要关注点是磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D在糖尿病中性粒细胞和心脏、血管、肾脏、神经组织细胞中的酶活性改变，及其引起糖尿病各种并发症改变的信号传导途径。PLD3、PLD4、PLD5基因是最近克隆出来的，它们具有与PLD1、PLD2相似的功能域（图1），但其功能和表达调控的研究才刚刚开始。总之，PLD作为细胞信号传导中重要的酶分子，参与了细胞功能的诸多方面，其具体的作用机制研究成为目前关注的热点。

1.1 磷脂酶D家族的分子结构

所有克隆得到的真核生物PLD都具有一个相对保守的核心催化功能域（PLDc）、N-末端、C-末端区域。PLD催化核心域一般有Ⅰ～Ⅳ个域组成。在这4个短序列区域中，域Ⅰ和域Ⅱ、域Ⅲ、域Ⅳ具有特别相似的结构。保守域Ⅱ和Ⅲ之间插入的不同非保守片段也说明了这一点，并且这些插入片段或者Loop区对于人PLD1活性并非必需。除了域Ⅰ～Ⅳ域，在酵母、人和线虫的序列中仍有其他的结构域，如核心催化功能域HKD基序，N末端的PX域（phox domain）和PH域（pleckstrin donmain）。PLD家族成员都具有一个保守序列（HXKX4DX6GG/S），它具有的催化活性使得PLD家族成员有相似的作用机理。HKD基序在PLD 家族中具有高度保守性。对PLD1、PLD2的研究表明，HKD基序中的组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸残基是催化作用所必需的。HKD 基序是PLD 的标志序列，具有催化水解的活性。这意味着真核生物PLD基因可能由同一基因经过复制和融合等基因重组过程进化而来。

有研究表明，PH域对于蛋白质的定位至关重要，序列缺失和定点突变会导致该蛋白不能在细胞内正确定位。PH域介导PLD1结合到脂质筏上，促进该酶的早期复性从而使其转位到内涵体的质膜上[1]。删除PH域并不影响PLD的酶活性，也不改变PLD催化反应对PI-4，5-P2依赖性，这导致了PI-4，5-P2结合基序的发现[2]。研究发现，PLD的PX域能够介导蛋白质-蛋白质相互作用或者结合磷酸肌醇[3]。与其他磷酸肌醇单磷酸（如PI5P）明显不同，PX域能够优先与磷酸肌醇三磷酸结合[4]。相反，在脂质体结合分析中PX域却与PI5P优先结合，由于PI5P是细胞内吞所需要的脂质体，这将有利于PLD1从质膜进入吞噬泡。与PLD2不同，PLD1具有保守的LOOP域，这一功能域具有负调控元件的作用，将该功能域缺失会导致PLD1的活性下降3倍。对PLD3、PLD4、PLD5进行蛋白质功能域预测分析，发现它们都没有PH和PX功能域，但却均在2个催化活性域之间多出1个envelope功能域。envelope功能域一般存在于病毒包膜蛋白中，而结合在质膜上的PLD通常通过把磷脂转化成磷脂酸来改变细胞膜的脂质结构，从而调节细胞内的脂质运动，这预示着这3个磷脂酶D很有可能具有不同于PLD1、PLD2的功能。

1.2 磷脂酶D的细胞定位

PLD1和PLD2在细胞中的定位是不同的。通过研究不同细胞系发现，PLD1主要分布于核周际，如高尔基体、内质网或后期囊泡[5]。也有观点相反的报道认为，PLD1只分布于后期囊泡和溶酶体中，高尔基体中就没有PLD1的分布[6]，而在未被刺激的细胞中，PLD1只分布于质膜[7]。但是现在研究发现，受到外界刺激后PLD1会转移到质膜[8]。实际上，由于细胞系囊泡循环的频率和数量不同以及PLD1调控的定位，只能以细胞内PLD1动态循环的概念来解释。

PLD2主要分布于质膜[9]，同时在胞质、囊泡体[10]和β肌动蛋白[11]中也有分布。在血清和表皮生长因子（EGF）刺激下PLD2会转移到细胞膜褶皱上。

2 PLD代谢产物PA的功能

PLD水解产生的PA参与多方面的细胞代谢功能。PA既可以在细胞信号转导中起作用，如参与磷酸肌醇激酶的激活或作为蛋白质的脂类结合伴侣募集蛋白质等过程。PA也可以通过前面所述途径被转化成具有生物活性的脂质分子DAG和LAP，参与细胞内信号传导的调节。同时，PA在囊泡运输，内吞作用和分泌过程中都发挥着重要作用。总之，PA在以上这些过程中的功能通常是作为第二信使、脂类船坞和增融性脂质功能的联合，以下将分别讨论。

2.1 PA作为第二信使的作用

PA参与细胞内信号传导，包括激活PI4P 5-激酶，激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及与Raf激酶结合等许多通路。PA的1个重要下游靶标是Ⅰ型PI4P 5-激酶，它可以催化PI4P产生PI-4，5-P2。与其他脂类分子相比，只有PA可以在体外激活牛脑中提取的PI4P 5-激酶。后来研究表明，PA只能激活Ⅰ型而非Ⅱ型PI4P 5-激酶。Ⅰ型PI4P 5-激酶第3个变体的克隆和研究也证实了这一说法，并且这一过程与体内肌动蛋白聚合调控相关[12]。EGF介导PLD2的活化和转位导致质膜褶皱中PA的大量积累，从而激活质膜上PI4P 5-激酶来促进褶皱的产生。不但PLD产生的PA可以激活Ⅰ型PI4P 5-激酶α，而且PA的转化产物LPA处理猪动脉血管内皮细胞也能激活Ⅰ型PI4P 5-激酶α[13]。另外，PA双酰基链的组成也是也是PA研究的一个方面。双酰基链PA（8 ∶ 0）对PI4P 5-激酶具有相似的激活效率[14]。有研究表明，蛋黄提取物具有混合酰基链的PA，也能激活PI4P 5-激酶。因此，PA作为细胞内重要的信号传递分子，与其来源和酰基链的组成无关。

PLD与细胞抗凋亡的多种生存信号通路有关。作为细胞周期和增殖效应器的mTOR就是PLD抗凋亡的下游激活因子。在血清刺激下HEK293细胞内PA瞬时增加，从而导致mTOR及其下游蛋白S6激酶Ⅰ（S6K Ⅰ）的激活。体外研究发现，PA可以与mTOR在12-雷帕霉素结合域FK506直接作用[15]，与脂类分子（PC、PS、PE、PI和PIPs）相比，PA具有专一性。用mTOR抑制剂雷帕霉素处理细胞能够阻滞PA与mTOR作用，说明PA与雷帕霉素是竞争性结合的。超表达PLD2能够阻滞雷帕霉素，从而抑制细胞增殖，进一步说明PLD与mTOR调控有关[16]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可以刺激胞内PA增加，这一过程对mTOR激活介导的细胞因子的释放具有重要作用。佛波脂能加强细胞因子的释放，而丁-1-醇却阻滞这一过程，也说明PLD2参与其中。然而，有研究表明PLD1是mTOR信号的效应酶，并且也是Cdc42的下游分子。在血清刺激下，超表达衍生型PLD1能加强S6KⅠ的活性，而无活性PLD1的表达相对与对照组会减低S6KⅠ的活性。另外，干扰RNA（siRNA）干扰2种细胞系中PLD1能够基本完全抑制血清刺激下S6K Ⅰ的激活[17]。最近有研究发现，PLD1确实是mTOR激活的必需酶[18]。综上，mTOR是PLD1产生PA的确定靶标，并且这一途径与磷酸肌醇3激酶生存通路同时存在。

2.2 PA是脂类合成前体

PA能经磷脂酸磷酸水解酶（phosphatidic acid phosphohydrolase，PAP）转化生成脂质第二信使DAG。PAP的变体PAP2b经常出现在PLD2富集的膜区域，很有可能促进PLD生成的PA快速转化成DAG。DAG能够激活经典型和大多数PKC家族成员。PAP转化PA生成DAG的种类由PA二酰链的饱和度决定。值得注意的是，随着DAG的饱和度增高，便不能在体内激活PKC。因此，虽然这些高饱和度的DAG的作用还不清楚，但是它至少是消弱PLD生成PA信号的一种有效途径。PA也可以通过磷脂酶A转化成单酰基的LPA。LPA是一种有效的有丝分裂原，在细胞增殖、迁移和生存等过程中具有重要作用。但是有关PLD产生的PA转化的LPA和DAG的具体作用还有待研究。

2.3 PA在囊泡运输、吞噬作用和胞外分泌中的功能

PLD及其产物PA与细胞内囊泡运输、吞噬作用和胞外分泌等功能密切相关。PLD可以通过激活ARF促进高尔基体分泌泡形成。用一级醇（如乙醇）可以阻滞蛋白质从内质网到高尔基体的运输，但外加含有PA的脂质体能减弱这一过程。PA对蛋白质的募集依赖于高尔基体反式面分泌泡的形成。但是PLD在囊泡形成中的作用仍不清楚，PLD在高尔基体上的定位也有待于进一步研究。

相反，PLD在分泌泡形成和胞外分泌中的作用却比较清楚，这一过程主要依赖于ARF的激活。这些过程都曾在神经内分泌细胞、脂肪细胞、胰腺β细胞和肥大细胞做过研究[8，19]。在神经内分泌细胞中，ARF6专一性的通过PLD1依赖的PI-4，5-P2途径启动胞外分泌。最新研究表明，神经内分泌细胞的过程是通过PLD1的PH域调控，并且PLD也与人支气管内皮细胞中鞘氨醇1-磷酸诱导的白介素-8分泌有关[9]。

PLD2是细胞内吞作用中受体信号向胞内传导的重要媒介。表皮生长因子受体信号的传导能被丁-1-醇阻滞，并且EGF与受体结合后会促使胞内PA含量的增高，这都说明PLD参与其中。PLD1和PLD2的超表达均能引起受体信号的加强，而它们失活型的超表达均引起受体胞内信号的减弱[20]。μ-opioid受体MOR1与PLD2也有一定的功能性联系。研究发现，能加强胞吞作用的受体会激活PLD2，而其他受体均不能激活PLD2。另外，受体信号的向内传导是ARF依赖性的[21]。由于MOR1信号的向胞内传导会被丁-1-醇或失活型PLD2的超表达阻滞，因此PLD2在受体信号向胞传导中具有一定作用[21]。丁-1-醇和siRNA干扰PLD2均能阻滞谷氨酸受体介导的胞吞作用[22]。失活型PLD2的超表达和用siRNA干扰PLD2也均能阻滞血管紧张素Ⅱ受体信号引起的胞吞作用[9]。总之，受体的胞吞是PLD2在细胞内功能的重要体现。

PLD催化水解PC生成的PA具有促进细胞内囊泡运输等很多功能（图2）。PA能够作为脂质船坞募集蛋白，激活PI4P5-激酶生成PI-4，5-P2，具有增进质膜上脂质融合的作用。生成的PI-4，5-P2通过募集CAPS促进密集的囊泡进行胞外分泌[23]。由于PLD将非增溶性脂质PC转化成增溶性脂质PA，PLD在脂质融合中的功能倍受重视。PA的头部基团和脂质酰基链较小，也可以最大限度地降低内膜曲面形成负曲率的活化能[24]。PA同样可以更进一步形成另外2种增溶性脂类DAG和LPA[25]。LPA能够通过PI3K/PKCzeta通路激活PLD的活性[26]，也能促进PA所在膜反面曲率的形成[27]。LPAAT酶、endophilin又可以将PLA转化生成PA从而促进细胞内吞[28]。也有研究发现，添加PA能提高囊泡的融合率[29]。抑制PLD1的活性会减少质膜外围小叶上葡萄糖转运酶的数量，却不能阻滞囊泡向质膜的运输，这说明PA的生成缺乏会导致膜融合受阻[8]。综上所述，PLD生成的PA及其进一步的代谢产物（如PLA）在质膜融合和膜上囊泡形成中具有重要作用。

3 结论与展望

随着对PLD1、PLD2的深入研究，以及最近对PLD3、PLD4、PLD5的克隆，哺乳动物PLD的研究取得了重要进展。确定PLD1、PLD2许多功能性基序和蛋白域，对加深了解PLD调控规律和体内功能具有重要意义。PLD涉及到的细胞内反应与许多生理和病理过程相关，如在糖尿病及其并发症中许多组织也有PLD功能紊乱的迹象；PLD在神经退行性疾病中减轻神经细胞的凋亡、诱导神经细胞分化填补损伤区域及促进神经递质释放方面都起到一定的作用；PLD通过血管紧张素Ⅱ、去甲肾上腺素、氧化型低密度脂蛋白和多巴胺受体D5等分子参与高血压的发生；PDL也参与Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维中由胰岛素或肌肉收缩引起的肌细胞葡萄糖跨膜转运的信号转导系统；在许多肿瘤组织中，PLD 的活性异常升高，大量的研究表明PLD与肿瘤的关系密切。因此，PLD已被广泛认为是目前药物分子设计的重要靶标，加快对它相关功能和特征的研究就有重要意义。

PLD参与的信号通路主要是与PA相互作用的靶标蛋白质及其功能有关，因此与PA直接作用的蛋白质的研究成为目前研究的热点，它们之间相互作用至少有2个功能，即调控酶的活性、募集特定膜蛋白。理论模型研究表明，PA在PLD功能发挥如质膜融合中具有一定的作用。PA敏感蛋白TAPAS1、酵母Opilp的发现有助于更好地确定细胞内PA水平的变化及其与PLD和靶标的协调作用[30]。用质谱分析等先进的脂质检测方法可以分辨出一定刺激下细胞内PA分子种类的变化，确定出PA是来源于二酰甘油激酶作用多不饱和PA还是PLD酶解单不饱和PC或饱和PC。随着质谱分析灵敏度的提高，就可以通过分离亚细胞结构进一步分析PA的分子种类和分布，对PA的深层次研究有助于对PLD更加全面地了解。

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