血管钙化及其平滑肌细胞表型转化的调节机制

常晓丹 李丽华 张宝红

[摘要] 血管钙化常见于高血压、糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、慢性肾病、衰老等传统的老年病或慢性病，此外还可见于小儿，如新生儿期血管钙化、肺动脉高压、尿毒症性小动脉钙化等，均可危及生命。最近研究发现，血管钙化是一种多因素介导、可逆的、主动的调节过程，涉及多种细胞因子及信号通路，血管钙化的本质是血管平滑肌细胞向成骨细胞样表型转化，导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管硬化重塑，因此血管钙化及其平滑肌细胞表型转化相关的信号转导调节机制成为这一领域的重大研究课题。

[关键词] 血管钙化；血管平滑肌细胞；表型转化；信号通路

[中图分类号] R543.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0030-04

Regulatory mechanism of vascular calcification and its smooth muscle cell phenotype transformation

CHANG Xiaodan1，2 LI Lihua1 ZHANG Baohong3

1.Department of Neonatology， Bayi Children's Hospital Affiliated to Clinical Medical College in Beijing Military General Hospital of Southern Medical University， Beijing 100700， China； 2.Department of Neonatology， the Second Central Hospital of Baoding City， Hebei Province， Baoding 072750， China； 3.Department of Pediatrics， the Hospital of Tsinghua University， Beijing 100084， China

[Abstract] Vascular calcification is common in hypertension， atherosclerosis， diabetes， chronic kidney disease， aging， etc. Not only found in these elderly or chronic diseases， but also in children， such as neonatal vascular calcification， pulmonary hypertension， uremic small artery calcification， can endanger life. Recent studies have found that vascular calcification is a multi factor， reversible and active regulation process. It involves many kinds of cytokines and signaling pathways. The essence of vascular calcification is vascular smooth muscle cells to differentiate into osteoblast like phenotype， resulting in vascular wall thickening， lumen stenosis and vascular remodeling. Therefore， it is important to study the mechanism of vascular calcification and the modulation of the signal transduction pathway related to the phenotype of smooth muscle cells.

[Key words] Vascular calcification； Vascular smooth muscle cells； Cell phenotype transformation； Signaling pathway

血管钙化是一种类似于骨和软骨生理性矿化的主动的、可逆的、多种细胞因子介导的调节过程[1]。血管钙化可以根据位置分为四种主要类型：动脉粥样硬化内膜钙化、动脉中层钙化、心脏瓣膜钙化、钙化性尿毒症性小动脉病[2]。血管钙化的关键是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨細胞样表型转化，涉及细胞凋亡、氧化应激、代谢异常、信号通路等多种复杂的病理生理过程，而目前血管钙化及其平滑肌细胞表型转化相关的信号转导通路调节机制尚未完全明确，现将一些可能的机制综述如下：

1 血管钙化的起始环节

血管钙化过程中，血管壁矿化防御机制被耗竭，血管平滑肌细胞丢失原有表型而获得成骨表型，先后释放基质小泡和凋亡小体，为钙磷结晶提供合适的核心微环境。基质小泡（matfix vesicles，MVS）是细胞外的一种100～700 nm大小的膜包裹结构，富含多种磷脂和蛋白，钙磷脂结合蛋白通过激活钙通道活性，导致基质小泡内钙离子积聚，磷脂类以磷脂酰丝氨酸为主，具有富集钙离子和磷酸盐形成高度难溶的羟基磷灰石晶体，该晶体通过基质小泡膜的降解释放进入细胞外基质，与胶原蛋白连接，继而在细胞外环境的调节下不断生长形成矿化结节，因此基质小泡是钙化过程的初始矿化位点[3]。研究表明基质小泡来源于VSMCs衍生的凋亡小体，在受损的或死亡的VSMCs释放的基质小泡中含有羟基磷灰石单晶体，且在体外钙化培养的人主动脉平滑肌细胞（SMC），其钙化结节中心细胞在钙化早期就表现出核固缩、核碎裂等典型的凋亡特征，提示细胞凋亡和MVS的形成是血管钙化的始动环节[4]。

2 血管钙化与细胞因子

血管细胞外基质是一类由胶原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物质组成的动态网状结构，分为基膜（BMs）和间隙结缔组织（ICT）两大类，是维持血管壁结构完整和功能正常的必要保证，同时也是各种细胞因子的储存库。BMs主要包括Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和蛋白聚糖等，ICT则主要包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和氨基聚糖等，此外还包括多种骨分化相关蛋白，如骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等[5-7]。

胶原是构成细胞外基质的骨架，血管平滑肌细胞合成胶原的能力是血管内稳态的重要组成部分，主要分泌Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原蛋白，钙化血管也可以高表达Ⅱ型胶原。Blackstock等[8]发现，胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）可增加ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块胶原含量，而斑块中的胶原含量是斑块稳定性的一个重要标志，进而研究在钙化SMC，IGF-1显著增加larp6的表达，从而增加Ⅰ型胶原合成和胶原细胞外积累，促进纤维成熟，以维持动脉粥样硬化斑块内纤维帽的结构完整性。血管壁内存在一些维生素K依赖蛋白也是有效的钙化抑制蛋白，如OCN又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白、基质Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）等，这些蛋白均含有特异性谷氨酸残基，其共性是需在维生素K参与下经γ谷氨酸羧化酶催化产生γ-羧基谷氨酸发挥生物学效应[9]。OCN是由成骨细胞分泌的一种体内最丰富的特异性非胶原蛋白，其特异性谷氨酸残基可结合钙、磷和羟磷灰石，抑制骨中羟基磷灰石结晶的形成，OCN主要在血管细胞矿化形成期出现，因此被认为是血管平滑肌细胞向成骨细胞转化的标志之一。Pal等[10]学者研究表明在OPG缺乏的小鼠主动脉钙化模型以及具有间歇性跛行症状的主动脉钙化患者，循环单核细胞表达成骨细胞标志物OCN的百分比均显著下降，这表明骨髓来源的OCN阳性单核细胞在病变动脉分化为成骨细胞，促进血管钙化。MGP广泛分布于软骨和血管壁，在维生素K的参与下其谷氨酸残基羧化为活性形式，Gla与血清中游离钙离子结合，抑制钙盐沉积，并与钙化VSMCs产生的基质小泡及凋亡小体结合，抑制血管钙化的始动环节。MGP基因敲除所致的MGP缺乏的小鼠，其VSMCs失去收缩表型标志分子α平滑肌肌动蛋白，而表型转化特异性转录因子Osterix及Runx2的表达上调，碱性磷酸酶活性升高，骨桥蛋白表达增加[11]。OPG又称护骨素或破骨细胞抑制因子，是由成骨细胞分泌的糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，OPG/RANK/RANKL途径是近年来发现的在破骨细胞分化过程中的一个重要信号转导通路，OPG可作为诱饵受体与核因子κB受体活化因子（RANK）竞争性结合其特异性配体RANKL，阻止RANK与RANKL之间的结合，从而抑制破骨细胞前体的分化和激活，降低成熟破骨细胞的活性，诱导破骨细胞凋亡，增加骨密度。Callegari等[12]研究显示2/3的OPG基因敲除所致OPG缺乏小鼠在成熟之前即表现出严重的骨质疏松及主动脉和肾动脉中层的钙化，同时在钙化动脉还检测到RANK及RANKL的表达增加。BMPs是诱导骨发生的主要活性因子，属于转化生长因子-β（TGF-β）超基因家族成员，目前体内外实验均证实BMPs是具有诱导间充质细胞向骨组织方向分化的生长因子，其中BMP-2参与血管钙化的作用最为重要。Sage等[13]在高磷诱导的小鼠血管平滑肌细胞钙化模型，发现高磷培养基培养24 h显著诱导BMP-2和OPN的表达，7 d后BMP-2的表达更显著，且Osterix表达增加，但MGP的表达明显下调。OPN是由骨基质细胞产生的骨特异性的、含有唾液酸的分泌型糖基化非胶原蛋白，含有保守的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列的，从而发挥其特异性细胞黏附功能，例如OPN的RGD基序与破骨细胞表面的整合素αvβ3受体结合，其酸性结构域与细胞外基质的矿物质表面相互作用，酸化局部微环境，使矿物质溶解，抑制羟基磷灰石结晶的生长，实现抑制血管钙化的作用[14]。

3 血管钙化时细胞表型转化的调节

根据细胞结构和功能的不同，VSMC分为收缩型（分化型）和合成型（未分化型或去分化型）两种表型，在不同的生理和病理条件下，如血管损伤、机械牵张、生长因子的刺激，VSMCs可在收缩表型和合成型之间转化，该过程称为表型转化，呈可逆状态。正常血管中膜中的 VSMCs 以收缩型为主，是一种高分化的细胞，主要起维持血管形态以及收缩血管的作用，具有低增殖、低迁移、低蛋白分泌的特征；当发生动脉粥样硬化等血管病变时，VSMCs去分化成为合成型细胞，收缩性能下降，表现出高增殖、高迁移、高蛋白分泌等特征[15]。

VSMC中存在含量丰富的蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，SMα-actin），在收缩型细胞中呈优势表达，国内学者利用Nelin基因过表达和干扰慢病毒载体转染VSMC细胞模型，发现VSMC向收缩表型转化的早期SMα-actin的表达增加，说明SMα-actin是VSMC分化早期的特异性标志物[16]。SM22α（smooth muscle 22 alpha）作为一种重要的细胞骨架调节蛋白，其表达具有平滑肌组织特异性和细胞表型特异性，可作为一种肌动蛋白结合蛋白，促进肌动蛋白聚合形成应力纤维，参与细胞骨架重构和表型调节[17]，是收缩型VSMC的表达标志物之一。体外诱导VSMC由合成型逆转为收缩型，SM22α转录活性明显增高，伴随VSMC细胞骨架结构由稀疏的网络状向致密的束状重构，同时利用构建的反义SM22α表达载体转染VSMC后，细胞收缩无力，骨架重构受阻，说明SM22α具有维持VSMC收缩表型的重要作用[18]。Runx2和Osterix是成骨细胞表型转化最关键的特异性转录因子，高磷诱导Runx2的表达增加，伴随着SMα肌动蛋白和SM22α损失[19]，人Runx2基因缺失将导致颅骨锁骨发育不良综合征，成纤维细胞生长因子（TGF）可通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径增强Runx2的活性，甲状旁腺素（PTH）可能通过蛋白激酶（PKA/PKC）途径活化Runx2，Nell-1则通过ERK1/2途径磷酸化Runx2，进而促进小鼠颅盖骨细胞分化[20]。Osterix是Runx2的下游基因，具有更多的选择性作用于成骨细胞的形成和骨矿化，在Osterix敲除鼠中可以檢测到Runx2的表达，在成骨细胞分化早期，Runx2和Osterix协同诱导内源性ALP、OPN基因的表达[21]。

VSMC表型轉化过程受多条信号转导途径的调节，主要包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径、PI3K、环磷酸腺苷（CAMP）三个途径。丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2是经典的MAPK信号转导途径，细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）包括ERK1和ERK2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，磷酸化激活的ERKl/2才具有生物学活性，介导细胞增殖与分化。Ding等[22]原代培养大鼠成骨细胞，在MAPK-ERK1/2高水平激活状态下，成骨细胞表型转化特异性基因Runx2、Ⅰ型胶原和ALP表达水平出现显著的增加及促进增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。Ge等[23]在转基因COS7细胞，ERK1/2与P38/MAKP信号通路通过与 S301和S319磷酸化位点结合，协同刺激成骨细胞的基因Runx2磷酸化，导致细胞外基质Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白（BMP）的表达增加，而加入抑制剂UO126可抑制ERK磷酸化和Runx2活性，最终明确ERK1/2途径调节成骨细胞表型转化的基因表达。PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，能被酪氨酸激酶受体家族（receptor tyrocine kinase，RTK）激活，AKT又称蛋白激酶，是PI3K下游直接靶蛋白，RTK与其配体结合后引起胞质区域内酪氨酸残基自身磷酸化，并招募含有PH结构域结合蛋白AKT到细胞膜表面，被激活的AKT通过对丝氨酸/苏氨酸位点MAPK、ERK、mTor的磷酸化来调节成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡。Akt及其下游蛋白是骨形成和骨重建的关键调控因子，Akt基因敲除小鼠骨骼缩短、骨化延迟，Suzuki等[24]利用肿瘤坏死因子（TGF-β1）诱导成骨细胞MC3T3-E1表型分化，研究发现Akt活性明显增加，成骨细胞分化特异性因子Osterix表达增加。cAMP信号通路又称PKA系统（protein kinase A system，PKA），通过腺苷酸环化酶活性的变化调节靶细胞内第二信使CAMP水平，使下游靶蛋白磷酸化，维持VSMC收缩型和促进其分化。Qiu等[25]用慢病毒介导的shRNA干扰技术沉默人骨肉瘤MG-63细胞系PKD1基因，导致细胞增殖和成骨分化受阻，碱性磷酸酶活性降低，细胞内钙沉积和Runx2、Osterix表达降低，而使用抑制剂H89降低cAMP和PKA的活性后，成骨细胞增殖、分化指标均有所恢复，这些研究结果表明cAMP/PKA信号通路在调节成骨细胞功能中发挥重要作用。

4 结语

血管平滑肌细胞是参与血管钙化最重要的血管细胞成分，其增殖、迁移、凋亡以及向成骨细胞样表型转化涉及多种细胞因子及信号转导通路的调节，基于上述理论基础，血管钙化相关抑制因子的研究将成为突破血管钙化这一医学难题的潜在靶点，而研究血管平滑肌细胞表型转化的机制对临床预防和逆转血管钙化的发病具有潜在的指导价值。

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（收稿日期：2015-11-23 本文編辑：张瑜杰）