龙井43号多酚氧化酶同工酶酶学性质研究

张书芹　许雷　陈盛虎　徐小云　黄莹婕　姚燕妮　黄友谊

摘要：以龙井43号[Camellia sinensis （L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]鲜叶为材料，经分离纯化获得多酚氧化酶-同工酶（PPO II），对其部分酶学性质进行了研究。结果表明，PPO II最适反应pH为6.0；抑制剂抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸对PPO II的抑制作用随抑制剂浓度的增加而增强；Cu2+浓度在0.25×10-7 mol/L时，PPO II活性最高；PPO II的Km为13.05 mmol/L，vmax为0.019 OD460/min。

关键词：龙井43号[Camellia sinensis （L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]；多酚氧化酶；同工酶；酶学性质

中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1487-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.031

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1）是茶树生理学与茶叶产品加工工艺学中极为重要的生物酶之一，因此一直是人们的研究热点[1-3]。当前对茶树PPO的研究已进入分子水平[4-8]，国外已有对茶树PPO同工酶进行分离纯化和酶学性质研究的报道[9-14]。然而，国内对茶树PPO性质的研究一直停留在粗酶的水平[15，16]，除对同工酶谱变化有研究外[17-19]，还未见任何分离纯化出同工酶及对同工酶性质进行研究的报道[20]。为此试验以适制绿茶的龙井43号茶树[Camellia sinensis（L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]为材料，分离纯化出一个PPO同工酶，并对其部分酶性质进行了探讨，以期推动对茶树PPO的研究与利用[1，21]。

1 材料与方法

1.1 材料

茶树鲜叶采摘于华中农业大学茶学专业教学基地中龙井43号茶树，鲜叶规格为1芽2叶，采摘时间为春季，采下后迅速于-80 ℃超低温冰箱内保存，备用。试验所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PPO同工酶分离 取龙井43号1芽2叶20 g，用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液4 ℃浸提12 h，然后4 ℃、9 000 r/min离心30 min，取上清液，滤纸过滤后即为粗酶液。将粗酶液用30 %～80 %硫酸铵沉淀，9 000 r/min离心30 min，弃上清液；用pH 7.2的磷酸盐缓冲液溶解沉淀，3 500 r/min离心30 min，脱盐3～4次；以上操作均在4 ℃条件下完成。将离子交换剂材料DEAE-Sepharose CL-6B用0.02 mol/L、pH 7.2磷酸盐缓冲液（4倍体积）进行预平衡，将样品加入预平衡柱。加样完成后，使之与柱材料结合20 min，然后分别用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L 的NaCl 0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液作为洗脱液，每个浓度梯度洗脱液为3～4倍柱体积，流速60 mL/h。收集峰值洗脱液于超滤离心管中，4 ℃、3 500 r/min离心，脱盐，浓缩至500 μL左右。各峰值洗脱液分别加入预平衡（用含有0.1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液进行预平衡）Sephadex G-150凝胶柱中，用相同的磷酸盐缓冲液洗脱，收集各峰值处洗脱液于超滤离心管中，4 ℃、3 500 r/min离心，脱盐、浓缩至约250 μL左右，4 ℃保存，备用。

1.2.2 抑制剂对PPO同工酶活性的影响 取10 μL酶液，以邻苯二酚为底物，分别加入终浓度为0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mmol/L的抑制剂反应混合液75 μL，按文献[22]、[7]的酶活性测定方法，在37 ℃条件下反应30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反应，于酶标仪460 nm处测其残留酶活性，结果以残留酶活性与未加抑制剂的酶活性相比的百分数表示。抑制剂分别为亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸。

1.2.3 pH对PPO同工酶活性的影响 配制pH分别为5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，分别取上述缓冲液4 mL和邻苯二酚1 mL配制反应混合液，在10 μL酶液中加入75 μL的反应混合液，于37 ℃条件下反应30 min，然后加入50 μL 6 mol/L的尿素终止反应，在酶标仪460 nm处测其活性。

1.2.4 底物浓度对PPO同工酶活性的影响 以不同浓度的邻苯二酚为底物，在10 μL酶液中加入75 μL终浓度分别为5、10、15、20、25、30 mmol/L的邻苯二酚反应混合液，按文献[22]、[7]的酶活性测定方法，在其最适pH的缓冲液中，于37 ℃条件下反应30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素终止反应，在酶标仪460 nm处测定PPO的活性。用双倒数曲线来求取Km值和最大反应速率vmax。

1.2.5 铜离子对PPO同工酶活性的影响 取10 μL酶液，加75 μL终浓度分别为 0、0.25×10-7、0.50×10-7、1.00×10-7、2.00×10-7、3.00×10-7 mol/L的Cu2+反应混合液，按文献[22]、[7]的酶活性测定方法，在37 ℃条件下反应30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素终止反应，在酶标仪460 nm处测其活性。

1.3 蛋白电泳方法

1.3.1 非变性蛋白电泳方法 PPO同工酶采用非变性凝胶不连续垂直板电泳（Native-PAGE）法，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为7.5%，每孔上样量为20 μL。预电压为稳压50 V，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压调至稳压110 V，冰浴条件下进行电泳。结束电泳后，将凝胶置于染液（60 mL 1%邻苯二酚，20 mL 0.6 g/L对苯二胺，20 mL pH 7.2的 0.05 mol/L磷酸缓冲液）中 ，室温染色30 min后，蛋白胶用去离子水冲洗、浸泡至PPO同工酶带清晰为止。

1.3.2 变性蛋白电泳方法 PPO蛋白纯度采用变性凝胶不连续垂直板电泳（（SDS-PAGE）法，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%，每孔上样量为20 μL。开始电压为60 V，在溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压调到120 V。当溴酚蓝指示剂距分离胶底面1 cm左右时结束电泳，然后进行考马斯亮蓝染色处理。

1.4 PPO同工酶活性测定方法

根据文献[22]、[7]的酶活性测定方法，经过改进进行PPO活性测定。具体步骤如下：用移液枪取10 μL PPO酶液加入酶标板，再加入0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液50 μL和75 μL反应混合液，在37 ℃条件下反应30 min，即刻加入50 μL的6 mol/L尿素溶液终止反应，然后利用酶标仪在460 nm波长处测其吸光值，对照组选用煮沸5～10 min的PPO酶液来代替待测的样品。反应混合液配制方法按0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液∶0.1%脯氨酸∶1%邻苯二酚=10∶2∶3的比例配制，现配现用。在试验测定条件下，将以邻苯二酚为底物的反应液吸光值每分钟增加0.001定义为1个酶活力单位（U）。

1.5 蛋白浓度测定

用考马斯亮蓝法测定PPO蛋白浓度，采用蛋白定量试剂盒测定。

1.6 数据处理

所有试验均重复3次，试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2003软件处理并作图。

2 结果与分析

2.1 茶树PPO同工酶纯化

茶树PPO经过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析进行纯化后，得到一个单一的同工酶，具体见表1。经SDS-PAGE电泳后，结果见图1。从图1-A可见，该同工酶为单一谱帶，可达到电泳的纯度，PPO单链的分子量大小约为53 ku。经Native-PAGE电泳，结果见图1-B，图1-B显示有2条同工酶谱带。依据该同工酶在离子交换柱层析中洗脱的顺序，将其命名为PPO II。经检测，PPO II的比活力为2 325.39 U/mg，纯化倍数约为1.36倍，活性得率为0.07%。

2.2 抑制剂对PPO II活性的影响

试验分析了亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸 3种抑制剂对龙井43号茶树PPO II活性的影响，结果见图2。从图2可见，抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸均对PPO II活性有抑制作用，并且随着抑制剂浓度的增加而增强。3种抑制剂对PPO II抑制效果的变化类似；在终浓度0.1 mmol/L之前，3种抑制剂随浓度的增加，对PPO II活性的抑制效果呈线性增强；至0.1 mmol/L浓度时，3种抑制剂抑制了PPO II 65%以上的酶活性；超过0.1 mmol/L浓度后，3种抑制剂抑制PPO II活性的降低程度趋于平缓。在3种抑制剂中，以抗坏血酸的抑制作用略强，其次为L-半胱氨酸，亚硫酸钠最弱；当抗坏血酸浓度为0.3 mmol/L时，PPOII残留的酶活性仅为6.98%。

2.3 pH对PPO II活性的影响

试验分析了不同pH对龙井43号茶树PPO II活性的影响，结果见图3。从图3可知，PPO II呈现两个活性峰，一个是在pH 6.0，一个是pH 7.6。但以pH 6.0的PPO II活性更高，约为pH 7.6处的2倍，由此可见PPO II的最适反应pH为6.0。

2.4 底物浓度对PPO II活性的影响

试验还分析了不同邻苯二酚浓度对PPO II活性的影响，结果见图4。从图4可以看出，随着底物浓度的增加，在5～25 mmol/L范围内PPO II活性呈上升趋势。但随着底物浓度的进一步增加，PPO II活性增加幅度逐渐趋于平缓，且在底物浓度为25 mmol/L时酶活性达到最大。根据Lineweaver-Burk方程，得出PPO II的Km为13.05 mmol/L，最大反应速率vmax为0.019 OD460/min。

2.5 铜离子对PPO II活性的影响

试验分析了添加不同浓度的Cu2+对龙井43号茶树PPO II活性的影响，结果见图5。从图5可知，Cu2+浓度对PPO II活性呈先促进后抑制的作用。随着Cu2+浓度的增加，PPO II活性升高；当Cu2+浓度为0.25×10-7 mol/L时出现一个活性峰，随后活性随Cu2+浓度的增加而降低。当Cu2+浓度达到2×10-7 mol/L时，PPO II活性消失，说明同工酶在此Cu2+浓度时完全受到了抑制。

3 讨论

3.1 PPO II的肽链组成形式

已经发现的植物和微生物中的PPO同工酶绝大多数是同源二聚体，仅少数是单体或其他组成形式[22]。现在一般也认为茶树PPO同工酶也是同源二聚体，但也有报道在同一茶树中的PPO同工酶存在单体、二聚体、三聚体等多种形式[10，11]；本试验中暂未对PPO II的肽链构成进行分析。然而在对经过分子筛后的PPO II进行Native-PAGE电泳染色时，显示出有2条活性带，似表明有2个同工酶。但是试验在离子交换后的PPO II分离液进行非变性胶显色时，仅有一条活性带，变性胶显示也仅一条带。这表明茶树PPO II在分离纯化后的保存过程中，酶蛋白相互之间可能会产生一种聚合，但酶活性依然可以保留，这还有待于后续进行PPO II全酶分子量的测定以及分子组成形式分析来验证。

3.2 PPO II的最适反应pH

已有报道证明茶树PPO混合酶的最适反应pH为5.6[15，20]，但茶树体内也有单一PPO同工酶的最适反应pH为5.6左右的报道[10]，更有人发现茶树PPO混合酶的最适反应pH不在5.6，而是在8.6左右[16，23]。本试验中龙井43号茶树PPO II的最适反应pH为6.0，除此之外在pH 7.6时会产生另一个活性峰值。而试验在以不同pH的缓冲液进行龙井43茶树PPO蛋白粗提过程中，发现在酸性和碱性条件下均会产生一个酶活性峰值，但以酸性条件下的峰值更高。令人感兴趣的是在酸、碱两种完全不同的条件下，茶树PPO催化的机理是否完全一致、催化产物方面是否会有所不同还有待于后续试验来比较。

3.3 铜离子对PPO II的作用

铜离子是植物PPO催化活性中心的必需因子，已有研究证实铜离子是茶树PPO的重要组成部分[11，22]。试验中发现，Cu2+浓度在0.25×10-7 mol/L时酶活性最高，证实Cu2+可以提高PPO II的活性。而在基因表达的茶树PPO蛋白试验中，发现Cu2+浓度在1.0×10-7 mol/L时PPO活性最高[5]。这表明Cu2+应该是茶树PPO催化所需的因子。

由于试验仅对分离纯化获得的一个龙井43号茶树PPO同工酶进行了部分酶学性质研究，局限性不言而喻，还有很多酶学性质方面的问题有待于后续深入进行研究来解决。

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