茄病镰孢菌对铁皮石斛的致病性研究

孙惠芳　张发　刘娜　刘硕然　杨晓燕

摘要：研究茄病镰孢菌（Fusarium solani）对铁皮石斛（Dendrobium officinale）的致病性。试验组通过穿刺接种将茄病镰孢菌菌悬液接种于铁皮石斛组培苗及成苗的根部和叶片，植物发病后从病变植株中分离致病菌，并结合形态和分子生物学方法进行鉴定。正常对照组接种无菌水。对照组的铁皮石斛正常生长，试验组的铁皮石斛发生不同程度的病变，病原菌经形态和分子生物学鉴定显示为茄病镰孢菌。茄病镰孢菌对铁皮石斛有致病性。

关键词：茄病镰孢菌（Fusarium solani）； 铁皮石斛（Dendrobium officinale）； 致病性

中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1441-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.019

茄病镰孢菌（Fusarium solani）隶属真菌界半知菌类子囊菌门镰刀菌属，是一种广泛分布的植物病原菌[1，2]，如茄子根腐病[3]、百合枯萎病[4]、薯干腐病[5]、大豆猝死症[6]等均由茄病镰孢菌感染引起。该病原菌主要通过伤口感染植物，植物病株表现为叶片萎缩、发黄，根部软腐，严重的萎蔫枯死，是寄生能力和致病力都较强的土传病菌[3]。茄病镰孢菌也是草坪病害的主要病原菌[7]，同时还会引起人类真菌性角膜病[8]。

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属多年生附生草本植物，具有很高的药用价值和观赏价值，深受人们的喜爱。野生铁皮石斛远不能满足市场需求，因此铁皮石斛的人工栽培应运而生并实现了大规模种植，但铁皮石斛在移栽两年前后容易发病，若在栽培环节失误，将对铁皮石斛的产量和药材质量造成严重影响，从而造成较大的经济损失[9，10]。加强铁皮石斛病害的防治，是人工种植铁皮石斛非常重要的环节。真菌病是铁皮石斛的主要病害之一，目前相关研究表明棕榈疫霉菌（Phytophthora palmivora）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和串珠镰刀菌（F. moniliforme）可引起铁皮石斛的炭疽病、黑腐病、枯萎病、花枯病等真菌病害[11-15]，但关于茄病镰孢菌是否是铁皮石斛的真菌病害病原菌，尚未见报道。本研究采用人工感染的方法探究茄病镰孢菌对铁皮石斛的致病性，以期为铁皮石斛病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛组培苗由大理大学农学与生物科学学院组培室提供。铁皮石斛成苗购于大理市银桥镇铁皮石斛栽培基地，按每盆2～3株移植后置于室内，室温自然光照条件下培养30 d。茄病镰孢菌分离自大理白族自治州祥云县大波那温泉，中国科学院微生物研究所鉴定，大理大学农学与生物科学学院微生物实验室保存并提供。

1.2 培养基的配制

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的配制参照文献[16]进行。铁皮石斛分瓶生根培养基的配制参照文献[17，18]进行。

1.3 铁皮石斛组培苗生根培养

在无菌条件下对未生根的铁皮石斛组培苗进行分瓶。接好后置于26 ℃恒温培养箱中光照培养，待长出完整叶片和根后，在室温、自然光照条件下培养15 d可进行感染试验。

1.4 茄病镰孢菌菌悬液的制备

茄病镰孢菌在PDA培养基暗培养3 d，用无菌水漂洗菌落表面，制成孢子悬浮液[19]。

1.5 茄病镰孢菌感染试验

1.5.1 铁皮石斛组培苗感染试验 取铁皮石斛组培苗10瓶，随机分为A、B两组，每组5瓶，A组为试验组，B组为对照组。在无菌条件下，分别量取5 mL孢子悬浮液穿刺接种于A组组培苗的根部和叶片，对照组接种无菌水。将A、B两组置于室温、自然光照条件下隔离培养，定期观察并记录铁皮石斛的生长状况。

1.5.2 铁皮石斛成苗感染试验 取铁皮石斛成苗10盆，随机分为C、D两组，每组5盆，C组为试验组，D组为对照组。分别量取5 mL孢子悬浮液穿刺接种于C组成苗的根部和叶片，对照组接种无菌水。将C、D两组置于室温、自然光照条件下隔离培养，定期观察并记录铁皮石斛的生长状况。

1.6 病原菌的分离纯化

參照文献[20，21]对病变植株进行病原菌分离纯化培养。

1.7 病原菌的形态鉴定

单孢分离纯化培养物接种于PDA平板上，参照相关文献进行镜检[22]，观察气生菌丝、孢子梗和分生孢子等的形态特征，依据相关文献[1-3，23]进行形态学鉴定。

1.8 病原菌的分子生物学鉴定

1.8.1 病原菌DNA提取及凝胶电泳 对组培苗和成苗中分离纯化后得到的菌落（编号分别为1、2）采用改良的CTAB裂解法提取病原菌总DNA[24]，琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.8.2 PCR扩增 ①引物。采用真菌通用引物[25]，由上海生物工程有限公司合成。上游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。②体系。总体系为50 μL，配比为2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL（含10×PCR Buffer、Mg+、dNTP），引物ITS4 2 μL，引物ITS5 2 μL，ddH2O 32.5 μL，DNA Templat 1μL。③扩增条件。94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35次循环，最后再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[26]。④PCR扩增及产物检测。对1、2两个病原样本总DNA进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8.3 PCR产物测序 委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛组培苗感染结果

试验结果见图1。由图1可知，铁皮石斛组培苗接种3 d后，A组培养基表面均长满菌丝，部分植株的叶片接种部位变黄；6～7 d植株被菌丝布满，大部分叶片呈褐色及黄色，部分茎干变黄；8～10 d叶片枯黄部分下垂，茎干变黄，部分倒伏；12～15 d后植株死亡，植株表现为叶片枯黄或腐烂，部分茎枯黄、萎蔫甚至腐烂。B组正常。

2.2 铁皮石斛成苗感染结果

试验结果如图2所示，铁皮石斛成苗接种10～15 d后C组叶片接种处出现枯斑，部分叶片卷起，之后叶片似缺水萎蔫，颜色逐渐变黑发红直至枯黄脱落，30～60 d后叶片枯黄，部分茎开始腐烂、倒伏，根开始腐烂萎缩。D组正常。

2.3 病原菌形态学鉴定

将发病的组培苗和成苗植株内分离得到的病原菌在PDA培养基培养后，菌丝生长迅速，30 ℃培养4 d后菌落直径为52 mm，菌丝无色，分枝、分隔，宽0.5～5.5 μm。 孢子分隔，0～4隔（通常为1隔），孢子大小为7.50～49.00 μm（平均24.76 μm）×1.75～6.00 μm（平均4.22 μm）。分生孢子具小型和大型两种类型。孢子梗分隔、分枝或不分枝，长7.50～207.00 μm，基部宽1.00～4.50 μm，顶部宽1.50～2.50 μm，分生孢子与孢子梗连接处具刷状缘，呈扫帚状。厚垣孢子顶生或串生，大小为5.00～12.50 μm（平均9.11 μm）×5.00～11.50 μm（平均7.74 μm）。其形态特征与茄病镰孢菌相同[1-3，23]。

2.4 病原菌的分子生物学鉴定

对铁皮石斛病原菌5.8 S rDNA序列进行PCR扩增，得到阳性条带大小为500～750 bp左右的片段，将病原菌的5.8 S rDNA ITS区的测序结果与原始茄病镰孢菌5.8 S rDNA ITS区的序列在BioEdit软件中进行比对，结果如图3所示，病原菌的5.8

S rDNA ITS区与原始茄病镰孢菌5.8 S rDNA ITS区的同源性为100%。

3 小结与讨论

致病菌对植物的损伤通常都会使植株表现出一定的病变特征，因此，植物病变特征是确定病原的依据之一。在本研究中铁皮石斛组培苗发病植株表现为叶片枯黄或腐烂，部分茎枯黄、萎蔫甚至腐烂，病变明显；对照组生长正常。由此可初步确定试验组病变症状是由茄病镰孢菌感染所致。成苗试验组发病初期叶片似缺水萎蔫，后期萎蔫加重，叶片出现黄化之后枯萎，部分茎开始腐烂、倒伏，根开始腐烂萎缩。其症状与杨莹莹等[27]对镰刀菌属真菌引起的茄科植物枯萎病症及董诗韬[11]对镰刀菌属真菌引起的铁皮石斛枯萎病症相似。但在本研究中铁皮石斛成苗根部病变更为严重，且症状明显。结合对照组情况可初步确定茄病镰孢菌能够感染铁皮石斛成苗并使其发病。

为了进一步确定导致铁皮石斛组培苗和成苗发病的致病菌为茄病镰孢菌，本研究首先依据形态学鉴定方法，初步鉴定病原菌为茄病镰孢菌。在此基础上，运用分子生物学技术进行鉴定，其鉴定结果也显示该菌的5.8 S rDNA ITS区与原始茄病镰孢菌菌种的5.8 S rDNA ITS区序列同源性为100%，明确了从病变铁皮石斛组培苗和成苗中分离得到的病原菌为茄病镰孢菌，结合组培苗和成苗的发病状况分析可知，茄病镰孢菌感染能够导致铁皮石斛发病，但组培苗和成苗的发病过程存在差异，试验中铁皮石斛组培苗接种茄病镰孢菌菌悬液12～15 d植株全部死亡，病变植株表现为叶片枯黄、腐烂，部分茎枯黄、萎蔫甚至腐烂；成苗接种茄病镰孢菌菌悬液60 d后植株死亡病变，植株表现为叶片枯黄，部分茎腐烂、倒伏，根腐烂萎缩。相比之下铁皮石斛组培苗比成苗发病所需时间更短，病变症状更为明显，危害更为严重。

在本研究的前期试验中发现茄病镰孢菌能够捕食线虫，捕食线虫真菌都具有一定的生防作用，但是从本次研究的结果来看，茄病镰孢菌对铁皮石斛是有致病性的，在作为生防制剂使用时需慎重考虑。综合相关文献[28，29]，关于如何预防在铁皮石斛栽培过程中由茄病镰孢菌引起的病害提以下几点建议：①茄病镰孢菌生长最适pH为7.0～10.0，是一种喜偏碱性环境的病原真菌，因此适当提高土壤酸性，可施以偏酸性化肥如硫酸铵、氯化铵、过磷酸钙、磷酸二氢钾等；②茄病镰孢菌在30 ℃的生长速度较25 ℃的快，因此适当控制大棚内的温度，以减缓其生长速度；③茄病镰孢菌主要存在于土壤和作物的病残体中，在种植铁皮石斛时要及时处理作物的病残体，以便控制传染源。

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