张璇 郑兆浠 郑剑斌 李慧 周薇
[摘要] 目的 建立LC-MS/MS法检测小鼠血浆内FG-4592的浓度,研究FG-4592在小鼠体内的药代动力学。 方法 KM小鼠腹腔注射FG-4592 5 mg/kg,不同时间点采集血浆,样品经甲醇沉淀。选用Agilent Zorbax SB-Aq-C18色谱柱(2.1 mm× 100 mm,3.5 μm),柱温25℃,流动相为甲醇-水(含5 mmol/L甲酸铵,0.1%甲酸)(90∶10),流速0.35 mL/min。采用ESI离子源,正离子模式多反应监测,离子通道分别为m/z 353.1→ m/z 278.1(FG-4592)和m/z 294.9→m/z 235.0(内标物)。 结果 测定血浆中FG-4592的线性范围为1~1000 ng/mL,日内及日间精密度均<10%,准确度在90%~105%范围内,方法学考察均符合生物样品的分析要求。药代动力学参数:Cmax为(22.80±0.36)μg/mL,AUC(0-72)为(31.64±0.97)(μg·h)/mL,t1/2为8.81 h。 结论 本研究建立的FG-4592血药浓度测定方法可行,该药物在血液中吸收良好,测定结果可为药物的基础研究提供依据。
[关键词] FG-4592;高效液相色谱-质谱联用;药代动力学
[中图分类号] R969.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2016)03(c)-0014-05
[Abstract] Objective To develop a LC-MS/MS method for the quantitative analysis of FG-4592 in mice plasma and to study the pharmacokinetic profile of FG-4592 with this method. Methods KM mice were intraperitoneally administered 5 mg/kg FG-4592. The plasma samples were collected at different time points and precipitated by methanol. An Agilent Zorbax C18 (2.1 mm×100 mm, 3.5 μm) chromatographic column with the column temperature of 25℃ was used. The mobile phase consisted of methanol-water (contained 5 mmol/L ammonium formate and 0.1 % formic acid) (90∶10). The flow rate of mobile phase was 0.35 mL/min. The analyte was monitored by positive electrospray ionization (ESI) in multiple reaction monitoring mode. The mass transition pairs was m/z 353.1→ m/z 278.1 (FG-4592) and m/z 294.9→ m/z 235.0 (internal standard) respectively. Results The calibration curve was established in concentration range of 1-1000 ng/mL. The intra-and inter-day RSDs were both less than 10%. The method recoveries were within 90%-105% and met for the requirements of biological sample analysis. The pharmacokinetic parameters were as follows: Cmax was (22.80±0.36) μg/mL, AUC(0-72) was (31.64±0.97) (μg·h)/mL, t1/2 was 8.81 h. Conclusion This method is reliable. FG-4592 is well absorbed in mice blood and the results can provide the basis for fundamental research.
[Key words] FG-4592; LC-MS/MS; Pharmacokinetic
Roxadustat(FG-4592)是一种脯氨酸羟化酶(PHD)的小分子抑制剂,属于4-羟基异喹啉类衍生物[1],目前正处于治療慢性肾病患者贫血症状的三期临床试验阶段。2013年阿斯利康与FibroGen公司合作,计划使FG-4592于2017年上市,弥补现有红细胞生成刺激剂(ESA)治疗贫血症状的不足[2-3]。FG-4592 通过抑制PHD稳定缺氧诱导因子调控下游相关靶基因,主要参与血管生成、葡萄糖代谢、细胞迁移和胞外基质重塑等生理生化过程[4-7]。
最新研究表明长期给予PHD抑制剂可以提高健康小鼠的认知功能,增强突触可塑性[8]。FG-4497可减轻缺血性中风小鼠的脑组织损伤和水肿症状,具有神经保护作用[9],为有效治疗中风带来新的希望[10-11]。本课题组前期研究发现痴呆小鼠模型中,FG-4592具有显著的症状改善作用,为进一步研究该药物症状改善机制,亟需了解FG-4592在小鼠体内的药代动力学情况,以便优化日后的实验设计安排,为后续的研究工作提供依据。因此,建立一种可快速、灵敏地检测小鼠体内FG-4592浓度的方法必不可少。本研究采用LC-MS/MS法测定小鼠血浆中FG-4592的药物浓度,并将此方法应用到药代动力学研究中。
1 仪器与试药
1.1 药品与试剂
FG-4592(美国Selleck Chemical,批号:S100703,纯度99.39%);内标物(IS)由西北大学费因伯格医学院郑剑斌博士合成,纯度98%以上,是合成FG-4592的中间产物。甲酸、甲醇(美国Tedia公司)均为色谱纯,水为实验室自制,其他试剂均为化学纯。
1.2 实验仪器
Agilent 6410质谱仪(美国安捷伦科技公司),配有ESI-电喷雾离子源,MassHunter数据采集处理工作站;Agilent 1200液相色谱系统(美国安捷伦科技公司),配有G1311A四元梯度泵,G1322A在线真空脱气机,G1329A自动进样器,G1316A柱温箱;XS 105dual range分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);-80℃冰箱(美国Thermo Fisher scientific公司);高速冷冻离心机(德国Sigma公司);涡旋振荡器(美国Scientific industries公司)。
1.3 实验动物
6周龄健康昆明小鼠,雌雄各半,体重20~25 g,许可证号:SCXK(沪)2004-0001,由上海交大医学院实验动物中心提供。本实验由上海交大医学院实验动物伦理委员会批准。
2 方法与结果
2.1 测定条件
2.1.1 色谱条件 选用Zorbax SB-Aq-C18 column(2.1 mm×100 mm,3.5 μm;Agilent Technologies,美国)色谱柱,流动相为甲醇与水(内含5 mmol/L甲酸铵,0.1%甲酸)混合,比例为90∶10。柱温25℃,流速0.35 mL/min,进样量5 μL。
2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源,采用正离子模式扫描;离子源电压4 kV;干燥气流速为8 L/min,喷雾气压力为25 psi,干燥气温度350℃。多反应监测的各参数见表1。FG-4592及IS化学结构式见图1。
2.2 溶液的配制
2.2.1 FG-4592小鼠给药溶液的配制 精密称取适量FG-4592,以丙二醇∶PBS=15∶85作溶剂配制5 mg/mL溶液,临用前用PBS稀释1/10,给药剂量5 mg/kg。
2.2.2 FG-4592标准溶液和内标IS溶液的配制 精密称取FG-4592和IS各1 mg,用甲醇(含0.1%甲酸)分别溶解,制得1 mg/mL的标准溶液。
2.3 血浆样品的处理
2.3.1 空白血浆样品的制备 在小鼠清醒状态下脸颊刺血约0.1 mL至包被肝素的EP管中,4℃ 4000 r/min离心10 min,吸取上清加入0.1%甲酸,-80℃保存。
2.3.2 样品的处理与测定 取空白血浆或稀释后的血浆样品45 μL,加入甲醇(含0.1%甲酸)或FG-4592标准液5 μL混匀后,用200 μL含IS 20 ng/mL的甲醇(含0.1%甲酸)溶液沉淀蛋白,涡旋,14 000 r/min离心5 min,取上清150 μL于进样小瓶中,进样量5 μL。
2.4 专属性实验
取小鼠空白血浆45 μL,加入5 μL甲醇溶液,按“2.3.2”项下方法操作,得空白血浆的色谱图(图2a)。将5 μL 1000 ng/mL FG-4592溶液加入45 μL空白血浆中,按“2.3.2”项下方法操作得色谱图(图2c)。小鼠腹腔注射5 mg/kg FG-4592 10 min后的血浆处理进样,得色谱图(图2d)。结果表明FG-4592和IS的保留时间分别为1.2、1.1 min,二者出峰附近无杂质峰干扰,峰形良好,说明方法有较高的特异性。
2.5 标准曲线及定量下限
用甲醇稀释1 mg/mL FG-4592标准液得到10、50、100、500、1000、5000、10000 ng/mL的标准品溶液,取45 μL空白血浆中加入5 μL上述不同浓度的FG-4592标准品溶液,得到终浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000 ng/mL的系列样品,按“2.3.2”项下方法操作。以样品药物浓度(X)与样品峰面积和内标峰面积之比(Y)进行回归,得到回归方程Y=0.020 625X-0.017 767,r=0.999,结果显示血浆药物浓度在1~1000 ng/mL范围内线性关系良好,定量下限为1 ng/mL。见图2b。
2.6 精密度与准确度试验
用甲醇稀释1 mg/mL FG-4592标准液得到25、1000、7500 ng/mL的溶液,取45 μL空白血浆中加入5 μL上述溶液,配制成浓度分别为2.5、100、750 ng/mL的FG-4592质控样品,按“2.3.2”项下方法操作。每个浓度平行做5份,连续测定3 d。統计日内、日间精密度和方法回收率。3种浓度质控样品的日内、日间RSD值均≤2.09%,方法回收率在97.43% ~100.24%之间,精密度和准确度均满足生物样品分析要求。见表2。
2.7 提取回收率与基质性考察
FG-4592质控样品按“2.3.2”项下方法操作,进样得峰面积A1;45 μL空白血浆加入200 μL甲醇沉淀蛋白,涡旋,14 000 r/min离心5 min,原管分别加入25、1000、7 500 ng/mL的FG-4592溶液5 μL,混匀离心后取上清进样,得峰面积A2;三蒸水45 μL加入200 μL甲醇,涡旋后分别加入25、1000、7500 ng/mL的FG-4592溶液5 μL,混匀后14 000 r/min离心5 min,取上清进样,得峰面积A3。每个浓度平行做5份。以A1/A2×100%计算得FG-4592的提取回收率,以A2/A3×100%计算得到基质效应。低、中、高浓度质控样品的提取回收率均>95%,基质效应在94% ~100%范围内,符合生物样品的分析要求。见表3。
2.8 穩定性考察及稀释实验
取FG-4592质控样品分别考察室温放置4 h、处理后样品进样器内放置6 h、反复冻融3次、-80℃冰箱保存2周的稳定性,每个浓度检测3份样品,结果表明以上各条件下测定浓度与实际浓度的相对误差均在15%内,表明在此放置条件下FG-4592较稳定。空白血浆稀释FG-4592标准液得25 μg/mL的血浆样品,再用空白血浆稀释20倍,按“2.3.2”项下方法操作,结果稀释后测得药物浓度的RSD<5%,RE<10%,表明此方法可应用于高于标准浓度的FG-4592血浆样品分析中。
2.9 小鼠体内药代动力学
小鼠随机分为每个时间点6~8只,给药前12 h禁食,腹腔注射5 mg/kg FG-4592后于0.08、0.17、0.33、0.5、0.67、1、1.5、2、3、5、8、12、24、48、72 h分别脸颊刺血约0.1 mL,4℃下4000 r/min离心10 min,取上清加入0.1%甲酸。用空白血浆稀释20倍后,样品按“2.3.2”项下方法操作,计算各时间点的药物浓度,绘制血药浓度-时间曲线(图3)。结果血药浓度数据符合非房室模型,以WinNolin(Version 6.3)软件进行拟合,得药代动力学参数:达峰时间(tmax)为0.17 h,达峰浓度(Cmax)为(22.80±0.36)μg/mL,半衰期(t1/2)为8.81 h,AUC(0-72)为(31.64±0.97)(μg·h)/mL,清除率为157.81 mL/(h·kg)。见图3。
3 讨论
本文建立了一个灵敏、简便、快速的LC-MS/MS方法,对小鼠血浆中FG-4592的浓度进行检测,并针对药代动力学特征进行了考察。
FG-4592以正离子模式进行全扫描,确定母离子及定量子离子。选用FG-4592的合成中间产物作为内标,该中间产物保留了FG-4592的酰胺键,结构与其相似,质谱特征相近,并且与FG-4592的出峰互不干扰,因此是理想的内标[12]。本方法采用4倍体积甲醇沉淀蛋白,充分稀释基质,最低定量限的信噪比仍可达到15,满足定量分析要求。同时,蛋白沉淀这种方法更易实现高通量[13-15],每批样品(24个)处理不超过30 min。综上,本实验建立的LC-MS/MS法可专一灵敏的检测小鼠血浆内FG-4592的浓度,样品处理方法简单,可有效地运用到药代动力学的研究中。
对药动学参数进行分析发现,FG-4592在小鼠的血浆中半衰期较短,如需长期给药,需每日2~3次,药物在血浆中达峰较快,AUC较大,说明此药物在小鼠体内吸收快且吸收量大。若将该药物运用到治疗痴呆的小鼠模型中,仍需关注腹腔给药后外周血浆和中枢脑内的浓度比值,如外周浓度较高,则需注意在治疗痴呆的治疗剂量时,外周有无副作用发生[16-18],后期将进一步考察小鼠的脑药浓度并对给药方式进行改良。清除率157.81 mL/(h·kg),给药72 h后血浆中几乎检测不到药物的存在,表明需要在后期实验中对药物的有效浓度和停药后的药效做进一步研究[19-26],为以后的临床研究打下扎实的基础。
[参考文献]
[1] Besarab A,Chernyavskaya E,Motylev I,et al. Roxadustat (FG-4592):correction of anemia in incident dialysis patients [J]. Journal of the American Society of Nephrology,2015:ASN.2015030241.
[2] Flight MH. Deal watch:AstraZeneca bets on FibroGen's anaemia drug [J]. Nature Reviews Drug Discovery,2013,12(10):730.
[3] Bouchie A. First-in-class anemia drug takes aim at Amgen's dominion [J]. Nature biotechnology,2013,31(11):948-949.
[4] Bruick RK,McKnight SL. A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF [J]. Science,2001,294(5545):1337-1340.
[5] Smith TG,Talbot NP. Prolyl hydroxylases and therapeutics [J]. Antioxidants & redox signaling,2010,12(4):431-433.
[6] Myllyharju J. HIF prolyl 4-hydroxylases and their potential as drug targets [J]. Current pharmaceutical design,2009,15(33):3878-3885.
[7] Metzen E,Ratcliffe PJ. HIF hydroxylation and cellular oxygen sensing [J]. Biological chemistry,2004,385(3-4):223-230.
[8] Adamcio B,Sperling S,Hagemeyer N,et al. Hypoxia inducible factor stabilization leads to lasting improvement of hipp-ocampal memory in healthy mice [J]. Behavioural brain research,2010,208(1):80-84.
[9] Reischl S,Li L,Walkinshaw G,et al. Inhibition of HIF prolyl-4-hydroxylases by FG-4497 reduces brain tissue injury and edema formation during ischemic stroke [J]. PLoS One,2014 Jan 7;9(1):e84767.
[10] Yamashita T,Abe K. Recent progress in therapeutic strategy for ischemic stroke [J]. Cell transplantation,2016.
[11] Jones SM,Novak AE,Elliott JP. The role of HIF in cobalt-induced ischemic tolerance [J]. Neuroscience,2013,252:420-430.
[12] 徐新军,刘皋林,张正行,等.药物代谢动力学研究中分析方法建立时应注意的一些问题[J].药物分析杂志, 2001, 21(4):302-305.
[13] 李章万,徐秀荣.色谱分析中生物样品的前处理方法[J].药物分析杂志,1996,16(1):55-59.
[14] 邓阳,张毕奎,颜苗,等.LC-MS/MS测定大鼠血浆中16种胆汁酸及在甘草减毒研究中的应用[J].中国药学杂志,2015,50(3):263-268.
[15] 熊志立,俞嘉,何积芬,等.LC-MS/MS法测定人血浆中加巴喷丁的浓度及其药动学研究[J].药学学报,2011, 46(10):1246-1250.
[16] 陈原邻,刘喜明.阿尔茨海默病的中西医治疗进展[J].世界中医药,2014,9(1):113-116.
[17] 段磊,司继刚,刘萍.阿尔茨海默病药物治疗研究进展[J]. 河北医药,2015,37(7):1077-1080.
[18] 李德庆,张浩岩.治疗阿尔茨海默病的胆碱酯酶抑制剂的药动学研究进展[J].中国医药导报,2007,4(30):5-6.
[19] 许珍晶.阿尔茨海默病临床研究进展[J].中医药临床杂志,2014,26(2):194-196.
[20] 程勇,宋友华.阿尔茨海默病的药物治疗[J].中国临床药理学杂志,1999,15(4):295-298.
[21] 王悦,童建.高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬浓度[J].中国医学装备,2014,11(B12):105.
[22] 赵光,李珺,杜雪静.液相色谱-质谱联用法分析木瓜中绿原酸与抗癌活性成分的相关性研究[J].中国医学装备,2014,11(5):4-6.
[23] 宋学英,杨华,赵逸松,等.高效液相色谱仪的应用分析[J].中国医学装备,2015,12(1):29-31.
[24] 张晓旭,王洪平,杨阳,等.超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法快速鉴别生晒参中的皂苷类成分[J].中国医药导报,2015,12(9):130-136.
[25] 张小俊,赵志鸿,王桂芳,等.顶空固相微萃取与其他方法提取艾叶挥发性成分比较[J].中国医药导报,2015, 12(9):137-141.
[26] 苏玲,谢凤凤,唐玉荣,等.瑶药大肠风与小肠风挥发油成分气相色谱-质谱联用分析[J].中国医药导报,2014,11(36):83-87.
(收稿日期:2015-11-01 本文編辑:赵鲁枫)