鱿鱼软骨II型胶原蛋白提取方法及结构分析

郭休玉，何兰，位晓娟，王南平

上海市水产研究所 水产品加工研究室(上海， 200433)



鱿鱼软骨II型胶原蛋白提取方法及结构分析

郭休玉，何兰，位晓娟，王南平

上海市水产研究所 水产品加工研究室(上海， 200433)

目的从鱿鱼软骨中分离纯化非变性II型胶原蛋白， 并对其进行结构表征。方法将鱿鱼软骨冻干后粉碎成200目软骨粉， 用4%(w/w)NaOH溶液去除多糖、 0.5 M EDTA溶液脱灰对软骨进行前处理， 采用胃蛋白酶水解提取， NaCl盐析用纯水透析后冷冻干燥得到II型胶原蛋白样品。通过氨基酸组成分析、 SDS-PAGE电泳、 紫外吸收光谱、 电镜扫描等对制备的样品鉴定。结果制备的II型胶原蛋白具有3条α1链， 分子量112 kDa， 在224.5 nm波长处有最大紫外吸收， 具有三螺旋结构特征。

鱿鱼； 软骨； II型胶原蛋白； 结构

0　引言

II型胶原是纤维形成胶原， 与一些蛋白聚糖结合， 是软骨与玻璃液中的主要胶原[1]。国内外关于II型胶原的研究主要来源于鸡胸软骨， 1993年Trentham DE等[2]报导了采用鸡II型胶原蛋白治疗类风湿性关节炎的研究。

II型胶原蛋白由3条相同的α1链组成三维螺旋结构， 并通过共价键交联， 形成特殊的立体网状结构。软骨中II型胶原与蛋白多糖紧密结合(如图1)， 共同构成了软骨独特的功能性， 对保持软骨结构的完整性有着重要作用。

在海洋鱼类中同样具有丰富的软骨资源， 鲨鱼、 鲟鱼都是软骨鱼类， 鱿鱼的颈部也有软骨存在， 这些软骨通常在加工中废弃或者提取软骨中的多糖制备硫酸软骨素等[3]， 而II型胶原未被重视和利用。近几年II型胶原在生物医学工程中的研究主要集中在由T细胞参与自身免疫系统引起的类风湿关节炎的抑制[4]， 以及制备关节膜和凝胶促进软骨修复[5]。由于鱼胶原具有低抗原的特性， 所以鱼来源II型胶原蛋白的提取及结构分析是值得关注的领域。

图1　软骨基质组成示意图Fig.1　The composition of cartilage matrix

1　材料与方法

1.1原料和试剂

原料： 鱿鱼软骨取自浙江某公司捕捞的秘鲁鱿鱼， 剥离出软骨， 去除附着的筋肉， 将软骨切成2 cm大小， -40 ℃冷冻备用。

试剂： 胃蛋白酶， Sigma公司； 氢氧化钠、 氯化钠、 盐酸胍、 乙二胺四乙酸(EDTA)、 纯盐酸、 冰乙酸等均为国产分析纯。

1.2仪器和设备

FD-3冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)， FDV型气引式粉碎机(台湾佑崎有限公司)， BZS-200型标准振动筛机(新乡市恒信有限公司)， CR20B2型高速冷冻离心机(日本日立工机株式会社)， C-MAG HS7磁力搅拌器(德国IKA)， TF-CX-2型数控层析冷柜(上海田枫实业有限公司)， 岛津UV-1700紫外分光光度计(SHIMADZU)， Millipore Simplicity System纯水机(Millipore Corporation)。

1.3II型胶原蛋白的提取

1.3.1鱿鱼软骨基本成分

将鱿鱼软骨冻干， 向粉碎机中充入液氮， 在低温条件下粉碎， 筛分出200 目软骨粉， 测定鱿鱼软骨的基本成分， 如表1所示。

从表1可知， 鱿鱼软骨中蛋白质含量高达60%以上， 比鸡软骨蛋白质含量较高[6]， 灰分和脂肪含量显著低于鲨鱼软骨[7]。鱿鱼软骨中的多糖主要是硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate， CS)， 灰分主要是含有Ca2+的羟基磷灰石。软骨中II型胶原网状结构能为羟基磷灰石沉积提供框架， 蛋白多糖对羟基磷灰石有高度亲和力[8]， 使得II型胶原难以溶出， 在提取II型胶原时需对软骨进行除多糖和脱灰前处理。

表1　鱿鱼软骨基本组成成分(干基)Tab.1　Main components of squid cartilage

1.3.2鱿鱼软骨II型胶原蛋白提取流程

为保持II型胶原的结构完整， 获得非变性II型胶原蛋白， 所有操作及步骤均在4 ℃低温下进行。

本文采用酶法制备II型胶原， 流程如下： 鱿鱼软骨→冻干粉碎→200 目软骨粉→去除多糖→去离子水清洗→脱灰→去离子水清洗→胃蛋白酶水解→盐析沉淀→透析→冷冻干燥→II型胶原蛋白。

1.3.3去除软骨中的多糖

在4 ℃条件下， 分别加入软骨粉重量20倍体积的4‰(w/w)NaOH溶液、 4%(w/w)NaOH溶液和4 mol/L盐酸胍溶液， 缓慢搅拌24 h， 每隔6 h更换一次溶液并取出少量软骨粉样品， 去离子水完全清洗， 干燥后测定软骨粉样品中硫酸软骨素的含量。参照GB/T 20365-2006《硫酸软骨素含量的测定 液相色谱法》， 以HPLC法测定硫酸软骨素的含量。

1.3.4软骨脱灰处理

将去除多糖的鱿鱼软骨粉用去离子水完全清洗去除残留NaOH等， 4 ℃下分别加入20倍体积的HCl(pH 2.0)溶液和0.5 M EDTA(pH 8.0)溶液， 缓慢搅拌24 h， 每隔6 h更换一次溶液并取出少量软骨粉样品， 去离子水完全清洗干燥后测定软骨灰分。灰分测定参照GB 5009.4-2010《食品中灰分的测定》。

1.3.5II型胶原蛋白的提取纯化

将脱灰后的鱿鱼软骨粉用去离子水完全清洗干净EDTA等， 料液比(w/v)1： 30加入0.5 M乙酸溶液， 再加入0.2%(w/w)胃蛋白酶， 4 ℃条件下缓慢搅拌， 水解48 h， 4 ℃、 10 000 rpm离心30 min， 取上清液。

向上清液中加入饱和NaCl溶液至NaCl终端浓度达到4%[9]， 盐析沉淀II型胶原蛋白， 静置12 h， 4 ℃、 10 000 rpm离心。将II型胶原蛋白沉淀用0.5 M乙酸溶液溶解， 装入截留分子量100 kDa的透析袋中， 以纯水作为透析外液， 4 ℃透析3 d， 每12 h更换一次透析外液， 将透析好的胶液在真空下冷冻干燥得到II型胶原蛋白。

1.4II型胶原蛋白的结构分析

1.4.1氨基酸测定

参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》中样品处理方法， 取II型胶原蛋白样品溶于6 mol/L盐酸中， 110 ℃水解24 h， 采用Agilent1100高效液相色谱仪测定水解液中氨基酸含量。

1.4.2SDS-PAGE电泳测定

将II型胶原蛋白样品溶于Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L， pH 7.4， 25 ℃)， 取400 μg/mL II型胶原蛋白制品10 μL， 加入10 μL 2×SDS样品缓冲液。配制5%浓缩胶、 8%分离胶， 上样量10 μL， 电流15 mA。考马斯亮蓝染色， 醋酸溶液脱色后扫描。

1.4.3紫外吸收光谱测定

取少量II型胶原蛋白样品溶于0.2 M乙酸溶液中， 配制成浓度为0.5 mg/mL的II型胶原蛋白溶液， 以0.2 M乙酸溶液作为空白对照， 在190 nm～400 nm范围内进行紫外光谱扫描。

1.4.4电镜扫描

将制备的II型胶原蛋白样品送至华东理工大学分析测试中心， 采用日立S-3400扫描电子显微镜观测II型胶原蛋白表面成像。

2　结果与讨论

2.1鱿鱼软骨前处理工艺

2.1.1鱿鱼软骨去除多糖

图2表明， 经过4次处理后， 4 mol/L盐酸胍去除多糖效果最佳。蛋白多糖具有可溶于4 mol/L盐酸胍的性质， 但用盐酸胍处理后的鱿鱼软骨粉颜色显著加深， 且处理过程中盐酸胍消耗量巨大， 故不选用盐酸胍去除鱿鱼软骨中的多糖。

图2　不同试剂对鱿鱼软骨中硫酸软骨素的去除效果Fig.2　Effect of different reagents on removing chondroitin sulfate of squid cartilage

采用碱法去除多糖， 浓碱(4% NaOH)较稀碱(4‰ NaOH)效果更好， 原因在于硫酸软骨素与蛋白质结合的O-糖苷键可在强碱作用下发生β-消去反应， 使糖-肽键断裂， 硫酸软骨素从蛋白多糖中释放出来， 浓碱法的碱性更强， 有利于硫酸软骨素的降解[10]。鱿鱼软骨经浓碱处理24 h后， 硫酸软骨素含量低于1%。

本文选用4%(w/w)NaOH溶液去除软骨中的多糖， 料液比(w/v)1:20， 处理时间24 h， 每隔6 h更换一次NaOH溶液液。

2.1.2鱿鱼软骨脱灰处理

图3表明， 0.5M EDTA(pH 8.0)溶液脱灰效果显著好于HCl(pH 2.0)溶液。EDTA是一种螯合剂， 可与软骨中的Ca2+、 Mg2+离子结合， 形成水溶性络合物。经过EDTA溶液4次脱灰处理后， 鱿鱼软骨中灰分含量只有0.38%。

故选取0.5M EDTA(pH 8.0)溶液作为脱灰剂， 料液比(w/v)1:20， 脱灰时间24 h， 每隔6 h更换一次EDTA溶液。

软骨粉经4%(w/w)NaOH溶液和0.5 M EDTA(pH 8.0)溶液处理后， 加入0.5 M乙酸溶液和0.2%胃蛋白酶4 ℃水解48 h， NaCl盐析， 纯水透析， 冻干， 制得II型胶原蛋白。

图3　不同试剂对鱿鱼软骨的脱灰效果Fig.3　Effect of different reagents on deliming of squid cartilage

2.2II型胶原蛋白结构分析

2.2.1鱿鱼软骨II型胶原蛋白氨基酸组成

鱿鱼软骨II型胶原蛋白氨基酸组成如表2所示， 含量以每1 000个总氨基酸残基中的残基数表示。

表2　鱿鱼软骨II型胶原蛋白的氨基酸组成Tab.2　Amino acid composition of type II collagen from squid cartilage

表2表明， II型胶原蛋白中不含色氨酸， 芳香族氨基酸含量较少； 甘氨酸含量为34.1%， 约占总氨基酸的1/3； 羟脯氨酸和脯氨酸含量较高， 具有胶原蛋白的典型特征。

2.2.2紫外吸收光谱分析

鱿鱼软骨II型胶原蛋白的紫外吸收光谱如图4所示。

图4　鱿鱼软骨II型胶原蛋白紫外吸收光谱Fig.4　The UV spectrum of type II collagen from squid cartilage

由图4可见， 鱿鱼软骨II型胶原蛋白在224.5 nm处出现最大吸收峰， 此吸收峰与多肽链的氨基酸组成和螺旋程度相关[11]， 是胶原三螺旋结构的特征UV图谱谱型[12]。曹慧、 陆雪芹等制备的鸡软骨II型胶原紫外吸收在220 nm[6， 13]， 与鱿鱼软骨II型胶原相近。由于II型胶原中色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸等芳香族氨基酸含量很少， 在250 nm～280 nm区间未出现明显紫外吸收峰， 与氨基酸组成相一致。

2.2.3SDS-PAGE 电泳分析

鱿鱼软骨II型胶原蛋白电泳图谱如图5所示。样品条带分子量分别为条带1： 301 kDa， 条带2： 196 kDa， 条带3： 112 kDa。

图5　鱿鱼软骨II型胶原蛋白SDS-PAGE电泳图谱Fig.5　SDS-PAGE spectrum of type II collagen from squid cartilage

如图5， SDS-PAGE图谱中有3个条带， 未见其它明显杂带， 表明制备的II型胶原蛋白样品纯度较高， 有三条相同α1链组成的三螺旋结构。其中， 样品条带1为未解螺旋的II型胶原， 即(α1)3； 样品条带2为两条α1链组成的β二聚体； 样品条带3为单条II型胶原α1链。鱿鱼软骨II型胶原蛋白的分子量为112 kDa， 与鸡、 猪、 羊等来源II型胶原分子量相接近[14]。

2.2.4电镜扫描(SEM)分析

鱿鱼软骨II型胶原蛋白电镜扫描图， 如图6所示。

图6　鱿鱼软骨II型胶原蛋白电镜扫描图Fig.6　Scanning Electron Microscope of type II collagen from squid cartilage

电镜扫描图A显示， 鱿鱼软骨II型胶原蛋白由胶原纤维组成， 图B可看出胶原蛋白分子平行排列集聚形成纤维束， 是具有三螺旋结构的成纤胶原蛋白的特征之一[15]。

3　结论

鱿鱼软骨II型胶原含量丰富， 是一种理想的制备II型胶原蛋白的材料， 软骨中的多糖等非胶原成分则不利于II型胶原的提取， 须进行除糖脱灰等前处理。将鱿鱼软骨冻干后粉碎成200目软骨粉， 用4%(w/w)NaOH溶液去除蛋白多糖， 0.5 M EDTA溶液进行脱灰， 效果显著。将软骨冻干后在低温下粉碎， 不会使II型胶原因高温变性， 经过前处理的鱿鱼软骨粉， 能快速提取出II型胶原蛋白。酶解提取时间过长导致溶出的II型胶原降解成小分子蛋白， II型胶原得率降低， 本文胶原提取时间48 h。

本方法可有效提取鱿鱼软骨II型胶原蛋白， 冻干的II型胶原蛋白为白色海绵状， 疏松多孔， 有光泽， 不溶于水， 可溶于稀醋酸。经真空冷冻干燥的II型胶原蛋白可保持胶原原有的理化性质和生物活性[16]， 水分含量少， 有利于长时间存放。II型胶原蛋白样品经SDS-PAGE、 紫外光谱、 电镜扫描检测， 具有完整的三螺旋结构， 由3条相同的α1链构成， 分子量为112 kDa。

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Extracting Technology and Structure Characterization of Type II Collagen from Squid Cartilage

GUO Xiuyu，HE Lan，WEI Xiaojuan，WANG Nanping

Aquatic Products Processing Lab，Shanghai Fisheries Research Institute(Shanghai, 200433)

ObjectiveExtract and purify native type II collagen from squid cartilage, and characterize its structure.MethodsFreeze-dry squid cartilage and pulverize them to 200 mesh powder, pretreat the powder with 4% (w/w) NaOH solution and 0.5 M EDTA solution to remove polysaccharides and deliming, and then pepsin hydrolys, NaCl dialyzed with purified water and freeze-dried are used to obtain the type II collagen. The collagen was characterized by amino acid composition analysis, SDS-PAGE electrophoresis, UV absorption spectra, and scanning electron microscopy.ResultsThe type II collagen prepared from squid cartilage possesses three α1 chain, and the molecular weight of it is 112 kDa. In addition, it shows maximum UV absorption at 224.5 nm, and performs triple helix characteristic.

squid, cartilage, type II collagen, structure

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.01.001

郭休玉，工程师，主要从事水产品精深加工，

E-mail: 10042724@163.com

TS254.4

A

1674-1242(2016)01-0001-05

2015-11-23)