富铬酵母诱变及突变株筛选研究

呼凤兰，贺莹，赵建英

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁033000）

富铬酵母诱变及突变株筛选研究

呼凤兰，贺莹，赵建英

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁033000）

主要通过3种诱变方式对酵母进行诱变，这些诱变方式包括紫外照射、化学剂诱变和复合诱变，并筛选出高产耐铬菌株。结果表明：通过紫外诱变，当诱变时间为100 s时，致死率达到80%，所以把100 s确定为最佳诱变时间，并筛选出了5株菌株，分别命名为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5；通过不同体积分数的DES对酵母进行诱变，最佳致死剂量是体积分数为4%的DES，与此同时，在这个酵母诱变过程当中，5株菌株被筛选分离出来；对酵母进行复合诱变时，选用4%的DES对待处理的菌样进行处理，处理时间为25 min，再利用紫外照射对菌悬液照射60 s，筛选出长得好的10只菌株，命名为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10；针对上述经过单一诱变和复合诱变的菌株进行第二次筛选，选出铬含量高的菌株F1、F2、F6、F9、Z1，其中F9的铬含量最高，达到13.4 mg/g。

铬；酵母；诱变；筛选

铬作为一种对生物体有着不可或缺作用的微量元素。对人来讲，随着年龄的增大，生物代谢速度的减缓，伴随细胞死亡，铬在生物体内的含量逐渐减少。虽然人体内铬含量很少，人体对其铬的需求量小，但是铬对人体的作用是至关重要的［1］。铬能够帮助胰岛素放大其功能效应，不仅能够加快细胞对葡萄糖的吸收速度，使人体在代谢过程中产生一系列的中间产物，进入不同的代谢途径，产生大量的ATP（三磷酸腺苷），为人体的日常活动提供大量的能量，而且能够降低血糖浓度，因此被称作一种血糖调节剂。作为人体内一种重要的血糖调节剂，在血糖浓度调节方面，特别是对糖尿病患者而言有着不可言喻的重要作用［2］。除了在血糖调节方面有着重要地位外，铬在人体的生长发育发面又有着其他微量元素不可替代的作用。铬既有助于生长发育，还对血液中的一些激素有控制作用。

当前，国内国外对微量元素的吸收越来越关注。能够富集微量元素酵母必然会引起人们的注意。酵母的这种能够富集微量元素的性能给科学家们提供了无限的想象空间，使得他们在科学研究上看到了在人体微量元素吸收方面的一缕曙光。在日常食用方面，酵母富铬食品渐渐深入人们的生活。富铬酵母食品的出现使得国内外的专家开始思考，将本来就不易于吸收的铬加入到各类食品中，通过转基因的手段将富铬酵母的基因插入到各类蔬菜水果当中，让人们不再因为缺铬而导致生病甚至死亡，让人们不再担心缺铬［3］。此次实验是在前人的研究基础上来对酵母富集铬进行的的深入研究，主要是利用紫外线诱变、化学诱变、复合诱变3种手段来对富含Cr3+的酵母进行传代培养，筛选分离出好菌株［4］。以便使富铬酵母进一步满足工业生产化需求，提高产品质量。

1　材料与方法

1.1主要试剂

酵母菌：吕梁学院生命科学系实验室提供。

液体培养基：即PDA培养基（potato dextrose agar）：马铃薯200 g（煮汁），葡萄糖20 g，无菌水1 L，pH自然。

固体培养基：液体培养基的基础上加蛋白胨10 g。

发酵培养基：配方同液体培养基。发酵培养基分装到容量为250 mL的摇瓶中，每个摇瓶中加900 μg/mL的铬。

筛选平板培养基：PDA培养基中将不同浓度梯度的铬加入其中。

硫酸二乙酯（DES）、盐酸、高氯酸、硝酸、75%乙醇、硫代硫酸钠、碳酸钠、铬标准液、三氯化铬、磷酸二氢钾、无水乙醇、硫酸镁、琼脂粉、葡萄糖一水、硫酸镁、蛋白胨、氢氧化钠：山西航科试剂有限公司。

1.2主要仪器

KDM型控温电热套：山东鄄城华鲁仪器公司；TX323L型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Neofuge 13型台式高速离心：上海力申科学仪器有限公司；ZYW-100D型恒温培养振荡器、ZXSD型生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；CSIO UV4C型多用台式暗箱紫外分析仪：北京赛百奥科技有限公司；XH-C型漩涡混合器：金坛市白塔新宝仪器厂；VIS-723N型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；G-2X-9146MBE型电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3方法

1.3.1生长曲线的测定

先将冷藏的菌种取出，用接种环在斜面培养基上挑一环菌，接种在液体培养基中，放在振荡培养箱中，把温度设置成28℃，转速设成180 r/min，在此种培养条件下培养24 h，每隔2 h从培养基中取2 mL菌液在600 nm处测吸光度［5］。

1.3.2菌体浓度的测定

用血球计数板来计数。

1.3.3诱变育种

1.3.3.1菌种的活化

将菌株连续传代两次，此时菌体就已经活化，可以使用［6］。

1.3.3.2酵母细胞悬液的制备

挑一环活化好的菌接种于上述液体培养基中，设置恒温振荡培养箱的温度30℃，转速180 r/min振荡培养6 h，然后从中取适量菌液于血球计数板计数，至镜检细胞浓度为1 mL菌液含有106个酵母菌［7］。从培养基中取1 mL于1.5 mL的离心管中，以8 000 r/min的转速在台式高速离心机中离心10 min，用无菌水将菌体轻轻冲洗两三次，并用振荡器振荡成菌悬液。

1.3.3.3紫外线照射

紫外照射诱变用波长为365 nm的紫外线进行照射，每隔20 s取1 mL照射过的菌悬液进行10倍梯度稀释，每个梯度都要用振荡器把菌液振荡均匀，然后使用移液枪分别取0.1 mL的菌悬液滴在平板中，用涂布器进行涂布分离，鉴于菌体浓度达到106个/mL，涂布时涂10-4、10-5、10-63个稀释度作为试验的空白对照，涂10-3、10-4、10-53个稀释度作为试验的诱变组。诱变后，在生化培养箱中，30℃培养条件下，避光培养，36 h之后，待菌落长出，在菌落计数器下进行计数。计算不同条件下的致死率，以致死率75%～80%的照射时间作为最佳诱变条件［8］。

1.3.3.4硫酸二乙酯（DES）诱变

将菌悬液分别转入已经加入16 mL磷酸缓冲液的50 mL锥形瓶中，接着再将体积分数为1%、2%、3%、4%、5%的DES 1 mL分别加入锥形瓶中，振荡处理50 min后分别加入20 mL 25%硫代硫酸钠溶液使反应停止，后续过程同紫外线照射操作方法［9］。

1.3.3.5复合诱变

将菌悬液转入50 mL锥形瓶中，加入16 mL磷酸缓冲液，再加体积分数为4%DES 1 mL，振荡处理25 min后加入20 mL 25%硫代硫酸钠溶液终止反应，用提前准备好的高压蒸汽灭菌锅灭过菌的培养皿平板，使用移液枪取5 mL的上述经过DES处理过的菌悬液于此平板中，将平皿放在台式暗箱紫外分析仪中，取下平皿盖，用波长为365 nm的紫外线进行照射，二者相距30 cm，照射60 s，后续过程同1.3.3.3［10］。

1.3.4筛选方法

初筛：试验所用样品经过上述物理诱变、化学诱变和复合诱变3种不同方式的诱变之后，在液体培养基中进行接种，环境为30℃，180 r/min摇床内进行振荡培养6 h，计数菌体数量级为106个/mL，用移液枪精确吸取菌液1 mL，对其进行离心，在一系列的梯度稀释后，在含有不同浓度Cr3+的经过筛选的培养皿平板上，吸取0.1 mL的菌液进行接种。其浓度分别是600、700、800、900、1 000 μg/mL。每个稀释梯度分别用涂布器涂布3～5个培养皿平板。涂好平板后，在生化培养箱中，30℃培养条件下，24 h之后，待菌落长的明显后，挑选长势较好菌落明显的菌，即能在较高Cr3+平板上生长的菌株，传代两次。在冰箱中进行菌种低温保藏，以便后期复筛使用［11］。

复筛：将初筛低温保藏的菌株分别取一环接入三角烧瓶中，三角瓶装100 mL的发酵培养基，设置温度为30℃，转速为210 r/min，在生化培养箱中培养1 d，待培养结束后的菌液离心、干燥测其生物量，测其铬含量。同时，将原菌株在同样条件下进行发酵，用以比较各诱变菌株与原始菌株生物量和铬含量［12］。

1.3.5铬标准曲线的测定

精确吸取标准铬使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别加2 mL2%的盐酸，定容到100 mL。用原子吸收分光光度计进行测试，在计算机上设置测试条件为：灯电流I=3 mA，狭缝=0.4 nm，波长=357.9 nm，燃烧器高度=8 mm，空气流量=7 L/min，乙炔气流量=2.5 L/min，空气压力=0.3 MPa，乙炔压力=0.09 MPa，用测定的吸光度值，得出铬的标准曲线。

铬标准使用液：配制浓度为为100 μg/mL Cr3+的溶液。

1.3.6总铬的初步测定

在接种之前，分别从20瓶配制好液体培养基中取出10 mL培养基于20支15 mL离心管中，作为对照组，以上述震荡培养条件为准，待菌摇床培养24 h后，重复初筛的操作步骤，3 000 r/min，20min进行离心，取出上清液放入试管内，作为试验所需要的样品。测定吸光度，在计算机上设置测试条件为：灯电流I=3 mA，狭缝=0.4 nm，波长=357.9 nm，燃烧器高度=8 mm，空气流量=7 L/min，乙炔气流量=2.5 L/min，空气压力= 0.3 MPa，乙炔压力=0.09 MPa，火焰类型：还原性黄色焰。测定接种前和接种后上清液的吸光度A和B，则A-B是初步测定的酵母吸收的铬含量。

1.3.7生物量的测定

取45 mL试验所得的菌液放入离心管中，转速为3 000 r/min，离心12 min，加入适量超纯水振荡，使富铬酵母没有沉淀，再次离心。此步骤反复两次，收集沉淀物，在60℃烘箱中烘24 h后称重，推断出100 mL菌液的生物量，即富铬酵母所测生物量［12］。

1.3.8总铬的测定

在研钵中，放入试验所得到的富铬酵母，进行研磨，得到富铬酵母粉。称取0.1 g～0.2 g铬酵母加碳酸钠进行加热，蒸干其中水分，调低温度将其中的水慢慢蒸发至只有固体的灰分，在600℃马弗炉中进行对试验所得的灰分进行灰化6 h后，出现白色或淡黄色的固体，一段时间后至冷却，使用蒸馏水冲洗马弗炉，待冲洗干净后，将冲洗液体倒入50 mL的标准容量瓶中并定容，测得吸光度值，根据标准曲线计算铬含量。

2　结果与分析

2.1酵母菌的生长曲线

酵母菌生长曲线见图1。

图1　酵母菌生长曲线Fig.1Yeast growth curve

从图1的酵母生长曲线可以看出，该菌在6 h生长速率最快，达到对数期，这时的菌最敏感，取这个时期的菌进行诱变，24 h达到稳定期。

2.2紫外照射的致死率

酵母菌紫外致死曲线见图2。

图2　酵母菌紫外致死曲线Fig.2Yeast UV lethal curve

从图2中的酵母菌紫外致死曲线可以看出，照射时间不断延长，致死率不断提高，当照射时间为100 s时，致死率达到80%，因此确定100 s为最佳诱变时间。从100 s后，致死率趋于平缓，达到90%。

2.3DES诱变的致死率

酵母菌化学诱变致死曲线见图3。

图3　酵母菌化学诱变致死曲线Fig.3Yeast chemical mutagenesis lethal curve

从图3中可以看出，随着化学剂量的增大，致死率越来越高，当DES剂量为4%时的致死率为80%，4%为最佳剂量。同时筛出5株长得好的菌株，分别为H1、H2、H3、H4、H5。

2.4复合诱变

经4%DES化学诱变后，再经紫外诱变60 s，在筛选培养基上900 μg/mL铬浓度菌长得最好，在铬浓度为1 000 μg/mL情况下，培养皿中长出的菌较小，因此将900 μg/mL铬浓度确定为复筛时最佳的铬添加量。将复合诱变后的菌株筛出10株，分别为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10。

2.5铬标准曲线

铬的标准曲线见图4。

图4　铬的标准曲线Fig.4Standard curve of chromium

2.6对铬富集能力强的菌株进行筛选

对铬富集能力强的菌株进行筛选见表1。

从表1中可以得知，富铬能力强的菌株有F1，F2，F6，F9，Z1 5株，其中F9菌株铬含量达13.4 mg/g。

3　结论

本课题组确定取培养6 h即处于对数时期的菌进行诱变，单因素诱变过程中确定紫外线最佳诱变剂量为100 s。DES最佳诱变剂量为4%。经过单一诱变和复合诱变的菌株进行第二次筛选，选出铬含量高的菌株F1、F2、F6、F9、Z1，其中F9的铬含量最高，达到13.4 mg/g，比诱变前提高了2.74倍。

表1　筛选富集铬的菌株Table 1Screening enriched chromium strong strain

［1］刘彩霓.微量元素铬营养研究及应用［J］.饲料工业，1996（8）：3-8

［2］王全杰，张燕.微量元素富集的研究进展［J］.食品工业科技，2011，452（6）：5

［3］Anderson R A.Essebtiality of chromium in humans［J］.Sci.Total Environ，1989，86：75-81

［4］张海波，张彦，杜支红.富微量元素酵母研究进展［J］.应用科技，2009，17（22）：19

［5］Timothy M.Fakler Nutrition And Sow Prolificacy［J］.Anim.Sci，1993，71（1）：25-29

［6］金花.微生物发酵法研制富铬酵母［D］.长春：吉林大学，2004

［7］窦捷香，黄登宇，裴晓丽，等.富铬酵母的制备及最佳工艺条件研究［J］.世界中西医结合杂志，2008，3（3）：1-2

［8］Ali Demirci.Enhanced Organically Bound Chromium Yeast Production［J］.Food Chem，2000，48：531-536

［9］王战勇.利用啤酒废酵母制备富铬酵母的研究［D］.长春：东北师范大学，2007

［10］肖浩平.富铬酵母发酵工艺研究［D］.无锡：江南大学，2004

［11］刘莉君.紫外线诱变选育富硒酵母及其培养条件的优化［D］.合肥：安徽农业大学，2007

［12］石秀侠，程茂基，赵彩艳，等.紫外诱变酵母1254的致死率及高产富铬酵母菌株的选育研究［J］.中国饲料，2006，12（26）：1-2

Mutation of Chromium-rich Yeast and Isolation of Mutants

HU Feng-lan，HE Ying，ZHAO Jian-ying
（Department of Life Science，Lvliang College，Lvliang 033000，Shanxi，China）

This research mainly through three mutagenesis ways to mutagenesis of yeast，the mutagenic methods including ultraviolet irradiation，chemical mutagenesis and compound mutagenesis，and filter out high-yield strains of resistant chromium.The results showed that：through ultraviolet mutagenesis，when mutagenesis time of 100 s，the fatality rate was 80%，so100 s was the best mutation time，and five strains（Z1，Z2，Z3，Z4，Z5）were screened；mutagenic yeast by different concentrations of DES（硫酸二乙酯），best lethal dose was the volume fraction 4%of DES，at the same time，during the process of yeast mutagenesis，five strains were isolated and screened out.When yeast compound mutation，bacteria samples treated with 4%of DES，the processing time was 25 min，and then irradiated with ultraviolet bacterial suspension 60 s，good-growing ten strains（F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8，F9，F10）were screened；screening of strains again aftering a single mutation and composite mutagenesis，selected chromium-rich strains F1，F2 and F6，F9，Z1，which the F9 chromium content was the highest，reached 13.4 mg/g.

chromium；yeast；mutation；screening

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.035

2016-03-03

吕梁学院科研基金项目资助（ZRQN201403）；山西省大学生创新创业项目（2015456）；吕梁学院大学生创新创业项目（CXCYZD201503）

呼凤兰（1980—）女（汉），讲师，硕士，研究方向：生物学。