高效液相色谱法测定蓝莓干中的原花青素含量

刘连新，刘郁，何伟平，田龙

（徐州工业职业技术学院化学工程学院，江苏徐州221140）

高效液相色谱法测定蓝莓干中的原花青素含量

刘连新，刘郁，何伟平，田龙

（徐州工业职业技术学院化学工程学院，江苏徐州221140）

建立高效液相色谱测定蓝莓干中的原花青素的含量，用于评价产品的优劣。色谱条件：DiamonsilC18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为甲醇、乙腈与水，比例为75∶20∶5；流速：1 mL/min；检测波长为280 nm。该方法对原花青素具有良好的线性，Y=5 756.85X+2 715（0～100 μg/mL），R2=0.999 5；重复性和精密度良好，样品加标回收率在99.83%。RSD=0.204 0%。

HPLC；蓝莓；原花青素

蓝莓（Blueberry）又称越橘、蓝浆果，杜鹃花科越桔属多年生落叶或常绿灌木，果实为浆果，近圆形，呈蓝色，酸甜适度，果肉细腻，皮薄籽小。蓝莓是越橘属植物中营养成分最丰富的种类，除含常规的有机酸、糖以外，还富含多种维生素、超氧化物歧化酶、不饱和脂肪酸、矿物质等成分，以及原花青素、黄酮、尼克酸等特殊成分。原花青素（Origin Proanthocyanidin，OPC）是一大类多酚类化合物的总称。基本组成单元是儿茶素和表儿茶素，上下单元间以4-8或4-6位C-C键相连，形成具有不同聚合度的混合体。原花青素具有很强的抗氧化和消除自由基的生理活性，其抗自由基氧化能力大约为维生素E的50倍，维生素C的20倍；具有抗高血压、内皮依赖性血管舒张活性、抗缺血-再灌注损伤、抗动脉粥样硬化以及抗血小板凝固等作用；对多种癌细胞如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、皮肤癌细胞等都具有不同程度的抑制作用；还可以促进与调节眼睛中视网膜中的视紫质再生，预防近视与提高视力。本文主要是研究采用微波提取蓝莓干中原花青素的方法，用HPLC测定蓝莓干中的原花青素的含量，根据含量可以评价该产品的优劣，来规范该产品质量的评价方法，提高并推进蓝莓与加工产业的发展。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

KQ-100B超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；L2000高效液相色谱仪：日本日立株式会社；Milli-Q Advantage Merck Millipore纯水机：Merck Millipore USA；201s赛多利斯电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

蓝莓干：吉林产；原花青素：上海哈灵生物科技有限公司，HL20150612；乙腈、甲醇：sigma公司生产，为HPLC级别；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1HPLC色谱测试条件［1-3］

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：280 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。

1.2.2对照品溶液的制备

精密称取原花青素对照品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，先用部分甲醇溶解，超声10 min，定容，超声，用0.25 μm微孔滤膜过滤，得100 μg/mL的对照品贮备溶液。

1.2.3样品溶液的配制

取蓝莓干样品1.500 0 g，切碎，加入不低于80%的甲醇15mL，加入磷酸调节pH=3.5，温度控制在80℃，微波提取45 min。过滤提取液体，取上清液0.5 mL，用甲醇稀释到50 mL。样品用0.25 μm的微孔滤膜过滤，得待测样品溶液，装入样品瓶中，备用。

2　结果与讨论

2.1进样精度

按照1.2.2项下对照品溶液制备方法，配制溶液，按照1.2.1项下的色谱方法测定，记录峰面积，结果见表1所示，相对标准偏差（RSD）为0.317 9%。

表1　精密度试验（n=6）Table 1Precision experiment（n=6）

2.2标准曲线的绘制

分别精密移取对照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分别置于5 mL的棕色容量瓶中用甲醇稀释，超声、定容、用0.25 μm微孔滤膜过滤，注入样品瓶。按照1.2.1项下的液相方法测定，记录峰面积。以对照品进样浓度以（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=5 756.85X+2 715（0～100 μg/mL），结果见表2所示，HPLC色谱图见图1所示。

表2　浓度与面积关系Table 2Relationship of concentration and peak area

图1　原花青素标准品色谱图Fig.1HPLC chromatogram of standard substance of origin proanthocyanidin

2.3稳定性试验

取浓度为10 μg/mL的对照品溶液适量，分别放置于室温阴暗处1、2、4、6 h，按照1.2.1项下的液相方法测定，计算峰面积与含量。结果原花青素的RSD为0.781%，表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

2.4回收率试验

精密称取0.1mL的标准液，按“1.2.2”的制备方法及“1.2.1”项条件液相方法进行测定，进样分析，每个平行3次平行测定，计算其回收率。结果表明，平均回收率为99.83%，RSD为0.204 0%。结果详见详见表3所示。

表3　回收率试验Table 3Recovery ratio experiment

2.5样品含量测定［4-5］

取样品若干个，按照1.2.1项下的液相方法测定。记录峰面积，根据线性关系计算原花青素的含量结果见表4所示，平均含量在29.97 mg/g，RSD为1.210 8%，色谱图见图2所示。

表4　蓝莓干中原花青素的含量Table 4The content of PC in Blueberry

图2　蓝莓样品色谱图Fig.2HPLC chromatogram of blueberry sample

2.6讨论

2.6.1原花青素提取条件的选择

根据原花青素的性质，可以采用的提取溶剂有水、甲醇以及乙醇等。通过文献查阅以及前期的预作试验，确定甲醇为提取溶剂，甲醇浓度不低于80%（体积分数），用磷酸调节提取溶剂的pH=3.5，提取温度为80℃，提取时间为45 min。

2.6.2原花青素的提取方式

本研究在样品制备过程中采用微波提取，微波具有加热速度快，温度稳定，而且在加热过程中没有氧气，这样可以减少样品的氧化过程，提高了原花青素的稳定性，而且杂质含量较低。在微波提取过程中，采用搅拌子进行搅拌，速度为600 r/min。

2.6.3原花青素的稳定性

在稳定性的考察时，只考虑了1、2、4、6 h，因为原花青素的稳定性受周围光、氧气、温度等因素的影响，一般应控制在3 h之内检测，不建议放置时间过长。

3　结论

采用HPLC色谱法测定蓝莓干中原花青素的含量，紫外检测器，检测波长：280 nm，流量：1.0 mL/min，进样量：20 μL，流动相：甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20，检测温度为室温。该方法可以根据测定的原花青素的含量，评价产品的优劣。

［1］刘郁，刘连新，燕传勇，等.高效液相色谱法测定茶饮料中阿斯巴甜的含量［J］.现代食品科技，2012，28（12）：1810-1812

［2］刘郁，张念洁，刘连新，等.采用HPLC方法测定氟伐他汀钠分散片的含量［J］．吉林化工学院学报，2011，28（1）：23-25

［3］周玮婧，孙智达，谢笔钧，等.荔枝皮原花青素提取、纯化及抗氧化活性研究［J］.食品科学，2009，30（8）：68-71

［4］刘连新，刘郁，时光霞，等.液相色谱测定葡萄酒中白藜芦醇含量的方法研究［J］.食品研究与开发，2014，35（21）：103-105

［5］时光霞，刘郁，刘连新，等.红葡萄酒中合成色素的测定研究［J］.食品研究与开发，2014，35（10）：109-111

Determination of Proanthocyanidin in Blueberry by HPLC

LIU Lian-xin，LIU Yu，HE Wei-ping，TIAN Long
（School of Chemical Engineering，Xuzhou College of Industrial Technology，Xuzhou 221140，Jiangsu，China）

To evaluate the quality of the products，the HPLC method for the determination of the content of origin proanthocyanidin in blueberry was established.HPLC chromatographic conditions：Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）chromatographic column，flow phase：methanol∶acetonitrile∶water=75∶20∶5；flow rate was 1 mL/min，detection wavelength at 280 nm.The method had good linear relation，Y=5 756.85X+2 715（0-100 μg/mL），R2=0.999 5.The repeatability and precision were good，and the recovery rate was 99.83%.RSD= 0.204 0%.

HPLC；blueberry；origin proanthocyanidin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.029

2016-03-25

刘连新（1971—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：检验方法与数据处理。