血府逐瘀汤不同剂型数字化指纹图谱的构建*

杨　龙，杨　帆，杨欣莹，张　蕾，于卉娟，王跃飞

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津300193；2.天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津300457；3.天津宏仁堂药业有限公司，天津300385）

·中药研究·

血府逐瘀汤不同剂型数字化指纹图谱的构建*

杨龙1，2，杨帆1，2，杨欣莹3，张蕾1，2，于卉娟1，2，王跃飞1，2

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津300193；2.天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津300457；3.天津宏仁堂药业有限公司，天津300385）

［目的］建立一种有效的超高效液相色谱（UPLC）数字化色谱指纹图谱，评价血府逐瘀汤不同剂型的质量，为血府逐瘀汤制剂（胶囊、口服液、片剂、软胶囊、汤剂）质量控制提供参考。［方法］采用超高效液相色谱仪，以色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温50℃，体积流量0.3 mL/min，进样量2 μL，检测波长为280 nm，0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～8 min，3%～8%B；8～24 min，8%～19%B；24～35 min，19%～45%B）。［结果］构建了血府逐瘀汤多种剂型的指纹图谱。以野漆树苷为参照峰，共标定了30个共有峰，通过标准品比对确定了血府逐瘀汤不同制剂指纹图谱中的16个共有峰。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）评价了血府逐瘀汤不同制剂指纹图谱相似度均大于0.81。以血府逐瘀汤不同剂型共有峰的相对峰面积为特征值进行主成分分析（PCA），不同剂型样品聚类在3个不同的区域，说明血府逐瘀汤不同剂型的质量存在明显差异。［结论］该方法构建的指纹图谱简便易行，为血府逐瘀汤不同剂型的质量控制研究提供依据。

血府逐瘀汤；数字化指纹图谱；主成分分析

血府逐瘀汤源自清代医学家王清任的《医林改错》，由当归、生地、桃仁、枳壳、牛膝、赤芍、柴胡、甘草、川芎、桔梗、红花11味药组成［1］，是桃红四物汤、四逆散（熟地黄换成生地，白芍换成赤芍）加桔梗、牛膝的变通方［2］，具有活血化瘀，行气止痛功效［3］，广泛用于治疗内外妇儿各科疑难病证属血瘀气滞证者，多用于心血管疾病包括冠心病［4］、心绞痛［5］等的治疗。血府逐瘀汤作为经典名方，临床疗效确切，基于血府逐瘀汤研究开发了多个现代制剂，包括血府逐瘀片、口服液、胶囊、软胶囊等多种剂型。血府逐瘀汤［6-8］中含有机酸（没食子酸等）、黄酮（羟基红花黄色素A、柚皮苷等）、皂苷（甘草酸等）、环烯醚萜类（芍药苷、芍药内酯苷等）和其他成分，化学物质群复杂，给血府逐瘀汤不同制剂的质量控制带来挑战。

目前研究建立的质量控制方法多以单一成分作为检测指标，不能全面真实的反映血府逐瘀汤的内在质量。指纹图谱是一种国内外公认的综合的、可量化的鉴别手段［9-11］，能够有效地体现中药成分的整体性，更好地评价中药的质量［12-13］。血府逐瘀汤已被开发成多个剂型，目前血府逐瘀汤的指纹图谱研究多限于单个制剂，未阐明指纹峰的化学结构。本课题组对血府逐瘀汤多种剂型开展了深入研究，采用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱（UPLC-ESI-MS/MS）对血府逐瘀汤及其多种剂型的化学成分进行了定量分析，采用超高效液相色谱-电喷雾串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-DAD/ESIQ-TOF MS）对血府逐瘀汤的化学成分进行定性分析，检测并鉴定了103个化学成分［14-15］。在此基础上，本研究开展了血府逐瘀汤不同剂型的指纹图谱研究。

本研究建立的指纹图谱分析方法时间仅为35 min，以野漆树苷为参照峰，建立了5个不同剂型的UPLC指纹图谱，共标定了30个共有峰。采用标准品比对的方法鉴定了绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素等16个共有峰。该方法具有全面、快速、可靠的优点，通过该方法可获得全面的指纹图谱信息，为血府逐瘀汤不同剂型质量控制研究提供依据。

1　材料

1.1仪器ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司，包括Waters ACQUITY二元泵，DAD检测器，自动进样器，在线脱气机，柱温箱，Empower色谱工作站）；超纯水仪（Milli-Q，美国Millipore公司）；Vortex-5涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；J25低温高速离心机（美国ThermoForma公司）；十万分之一天平（METTLER TOLEDO XS205，瑞士METTLER公司）；万分之一天平（METTLER TOLEDO AL204，瑞士METTLER公司）；SCIENTZ SB 25-12DTN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；JSP-200粉粹机（浙江永康金穗机械制造厂）。

1.2药品与试剂样品：血府逐瘀胶囊：TJHRT，批号：E03051、E03052、E03053、E03054、E03055、E03056、E03057、E03058、E03059、E03060、E03061、E03062、E03063。

血府逐瘀片：SXHT，批号：140903、150301；WFZS，批号：141111、150102；CQXEA，批号为 140414、140416、141204、150101、150102、150103、150104、150105、150106、150201。

血府逐瘀口服液：JLADYB，批号：1407001、1407024、1408010、1408011、1408017、1412028、1412030、1501013、1501014；SDHJT，批号：1312001、1403007。

血府逐瘀软胶囊：JLHNSH，批号：20140302、20140701、20140903、20141102、20150102、20150206、20150301、20150304、20150401、20150402。

血府逐瘀汤：实验室自制。

标准品：芍药苷（RS0453）、野漆树苷（THB-TS40S）、芍药内酯苷（RS0042）、柚皮素（THB-2S340）、竹节参皂苷IVa（THB-1S375）购自于天津拓海生物科技有限公司；柚皮苷（110722-200610）、没食子酸（110831-200803）、甘草苷（111610-201106）、甘草酸（110731-201317）购自中国食品药品检定研究院；绿原酸（WOZ-4-2）、蜕皮甾醇、甘草素、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚（纯度均≥98%）购自天津中新药业研究中心；羟基红花黄色素A（Q-008-14073）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

乙腈（Sigma-Aldrich公司，色谱纯），甲酸（天津市大茂化学试剂厂，分析纯），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2　方法

2.1溶液的配制

2.1.1对照品溶液的制备取芍药苷、野漆树苷、芍药内酯苷、柚皮素、甘草素、竹节参皂苷IVa、柚皮苷、没食子酸、甘草苷、甘草酸、绿原酸、蜕皮甾醇、橙皮苷、新橙皮苷、山奈酚、羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，分别加入50%甲醇水溶液，即得到浓度分别为：芍药苷（0.93 g/L）、野漆树苷（1.52 g/L）、芍药内酯苷（1.53 g/L）、柚皮素（1.09 g/L）、甘草素（1.12 g/L）、竹节参皂苷IVa（1.27 g/L）、柚皮苷（0.92 g/L）、没食子酸（1.17 g/L）、甘草苷（1.02 g/L）、甘草酸（0.98 g/L）、绿原酸（1.37 g/L）、蜕皮甾醇（1.18 g/L）、橙皮苷（0.87 g/L）、新橙皮苷（0.61 g/L）、山奈酚（0.69 g/L）、羟基红花黄色素A（1.27 g/L）的对照品储备液。取各对照品储备液100 μL，置于2 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，制成浓度分别为：芍药苷（0.047 g/L）、野漆树苷（0.076 g/L）、芍药内酯苷（0.077 g/L）、柚皮素（0.055 g/L）、甘草素（0.056 g/L）、竹节参皂苷IVa （0.064 g/L）、柚皮苷（0.046 g/L）、没食子酸（0.059 g/L）、甘草苷（0.051 g/L）、甘草酸（0.049 g/L）、绿原酸（0.069 g/L）、蜕皮甾醇（0.059 g/L）、橙皮苷（0.044 g/L）、新橙皮苷（0.031 g/L）、山奈酚（0.035 g/L）、羟基红花黄色素A（0.064 g/L）的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备血府逐瘀胶囊和软胶囊的内容物、片剂、汤剂粉末适量，研细，分别取上述样品0.5 g，精密称定，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液适量，超声20 min，取出，放凉，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，置1.5 mL EP管中14 000 r/min离心10 min，取上清液，即可。

精密量取血府逐瘀口服液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，置1.5 mL EP管中14 000 r/min离心10 min，取上清液，即可。

2.2UPLC色谱条件色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0～8min，3%～8%B；8～24 min，8%～19%B；24～35 min，19%～45% B。检测波长：280 nm，柱温：50℃，流速：0.3 mL/min，进样2 μL，记录35 min色谱图。

3　方法学考察

3.1精密度实验取血府逐瘀汤粉末，按照“2.1.2项”下方法制备供试品溶液，按照“2.2项”下色谱条件进样，连续进样6次，记录色谱图，以21号峰野漆树苷为参照峰，计算各个峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，峰面积占总峰面积大于3%的色谱峰的相对峰面积和各共有峰的相对保留时间基本一致（RSD＜1.68%），表明仪器精密度良好。

3.2重现性实验取血府逐瘀汤粉末，按照“2.1.2项”下方法制备供试品溶液6份，按照“2.2项”下色谱条件进样，记录色谱图，以21号峰野漆树苷为参照峰，计算各个峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，峰面积占总峰面积大于3%的色谱峰的相对峰面积和各共有峰的相对保留时间基本一致（RSD＜1.49%），表明该方法重现性良好。

3.3稳定性实验取血府逐瘀汤粉末，按照“2.1.2项”下方法制备供试品溶液，按照“2.2项”下色谱条件进样，在4℃条件下分别于0、2、4、6、8、10 h进行测定，记录色谱图，以21号峰野漆树苷为参照峰，计算各个峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，峰面积占总峰面积大于3%的色谱峰的相对峰面积和各共有峰的相对保留时间基本一致（RSD＜2.88%），表明血府逐瘀汤在10 h内稳定。

3.4延迟测试取血府逐瘀汤粉末，按照“2.1.2项”下方法制备供试品溶液，按照“2.2项”下色谱条件进样，测定，延长测试时间至1 h，观察有无滞后峰出现。结果表明：无滞后峰出现，结果见图1。

图1　280 nm下血府逐瘀汤指纹图谱延迟测试色谱图Fig.1　The chromatogram of time-delay analysis of fingerprint of Xuefu Zhuyu decoction at 280 nm

4　血府逐瘀UPLC指纹图谱的建立

4.1血府逐瘀汤不同剂型共有峰相对保留时间及相对峰面积的分析将血府逐瘀胶囊和软胶囊内容物、片剂、汤剂、口服液按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样2 μL，注入超高效液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件测定血府逐瘀汤不同剂型的指纹图谱，如图2～3所示，记录各个共有峰的保留时间及峰面积，以野漆树苷为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，共标定共有峰30个，通过标准品比对，鉴定了16个共有峰，结果见表1。

图2　280 nm下血府逐瘀汤标准指纹图谱（A）和混合对照品溶液的色谱图（B）Fig.2　Representative fingerprint chromatogram of Xuefu Zhuyu decoction（A）and mixed standards solution（B）at 280 nm

图3　280 nm下血府逐瘀胶囊（A）、口服液（B）、片剂（C）、软胶囊（D）、汤剂（E）指纹图谱Fig.3　Fingerprint of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction at 280 nm，A：capsule；B：oral liquid；C：tablet；D：soft capsule；E：decoction

表1　280 nm下血府逐瘀汤不同剂型指纹图谱共有峰的相对保留时间及相对峰面积（峰面积占总峰面积＞3%）结果Tab.1　Relative retention time and relative peak area（peak area accounting for more than 3%in total peak area）of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction at 280 nm

4.2相似度评价与分析将不同批次血府逐瘀制剂的色谱图导入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版），对不同批次血府逐逐瘀制剂的UPLC指纹图谱进行相似度评价与分析，进而评价血府逐瘀不同剂型的质量。

按剂型分类，通过对不同批次血府逐瘀制剂色谱图进行谱峰差异性和整体相似性评价的结果可以看出，血府逐瘀胶囊相似度均大于0.81，血府逐瘀片相似度均大于0.90，血府逐瘀口服液相似度均大于0.89，血府逐瘀软胶囊相似度均大于0.89，说明血府逐瘀制剂工艺和质量相对稳定。

4.3血府逐瘀汤不同制剂指纹图谱的PCA分析将血府逐瘀汤不同制剂的指纹图谱数据分别导入EZinfo软件，以相对峰面积为特征值进行PCA分析。如图4所示，5种血府逐瘀汤制剂聚类在3个不同的区域，胶囊、片剂、汤剂在一个区域，口服液和软胶囊各在一个区域，表明血府逐瘀汤不同制剂存在明显差异。从样本分布的疏密程度分析：胶囊、片剂、汤剂在空间分布相对集中，而口服液、软胶囊在空间分布相对分散，表明胶囊、片剂的质量均一性较好。

图4　血府逐瘀汤不同剂型指纹图谱的PCA结果Fig.4　Principal components analysis for fingerprint of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction

5　讨论

5.1血府逐瘀汤不同剂型数字化指纹图谱的构建针对于目前对血府逐瘀汤多剂型质量标准不统一的情况，本研究建立了基于UPLC-DAD技术一种快速、准确的血府逐瘀汤的UPLC指纹图谱分析方法，并应用于血府逐瘀汤及其制剂（胶囊、口服液、片剂、软胶囊）的质量评价。鉴定了血府逐瘀汤指纹图谱中的16个共有指纹峰，分别是没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、蜕皮甾醇、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、甘草素、新橙皮苷、柚皮素、山奈酚、竹节参皂苷IVa、甘草酸。血府逐瘀汤及其制剂指纹图谱的建立，进一步阐明了血府逐瘀汤的化学物质基础，为血府逐瘀汤的质量控制奠定了基础。

5.2血府逐瘀汤不同制剂指纹图谱差异分析血府逐瘀汤不同制剂指纹图谱存在明显差异，产生差异的原因可能与不同剂型的生产工艺有关：血府逐瘀片及胶囊［16］均是取炒桃仁半量、当归、赤芍、麸炒枳壳、川芎、柴胡粉碎成细粉，其余红花等五味及剩余炒桃仁的水煎液浓缩为稠膏，细粉与稠膏混合制成；血府逐瘀汤是采用全部药材提取后入药方式制成；血府逐瘀口服液［17］是柴胡、当归、麸炒枳壳、川芎先蒸馏提取芳香水，药渣和其余七味药经水提醇沉处理后经一系列制药工艺制成；软胶囊采用复方中全部药材经提取后提取物制成。

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［16］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015:851-853.

［17］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015:849-850.

（本文编辑：高杉，张震之）

The establishment of UPLC-Digitized fingerprinting of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction

YANG Long1，2，YANG Fan1，2，YANG Xin-ying3，ZHANG Lei1，2，YU Hui-juan1，2，WANG Yue-fei1，2
（1.Tianjin Modern Chinese Medicine Key Laboratory-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base，Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Hongrentang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300385，China）

［Objective］To establish a sensitive and specific UPLC-digitized fingerprinting of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction（capsule，oral liquid，tablet，soft capsule and Decoction）with UPLC-DAD technology.［Methods］The UPLC method was established by employing an ACQUITY UPLC®BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）with 0.1%formic acid aqueous solution（A）-acetonitrile （B）as mobile phase in a gradient elution（0～8 min，3%～8%B；8～24 min，8%～19%B；24～35 min，19%～45%B）.The detection wavelength was 280 nm.The flow rate was 0.3 mL/min and the column temperature was 50°C.［Results］The established method was employed to develop UPLC-digitized fingerprinting（UPLC-DFP）of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction.By choosing rhoifolin as reference，30 common peaks were obtained.16 of 30 common peaks of Xuefu Zhuyu decoction were identified by comparing with standards.The similarity of the multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction is over 0.81，which was evaluated by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（Version 2004A）.The relative peak area of common peaks as characteristic value was implemented to perform principal component analysis（PCA）.The multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction were classified as three clusters based on different quality.［Conclusion］This method was simple，and provided the basis for the quality control of multiple dosage forms of Xuefu Zhuyu decoction.

Xuefu Zhuyu decoction；UPLC-digitized fingerprinting；principal component analysis

R284.1

A

1672-1519（2016）09-0559-06

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.13

2016-03-30）

国家自然科学基金青年基金项目（81202877）。作者简介：杨龙（1988-），男，硕士研究生，主要研究方向为药物化学。

王跃飞，E-mail:wangyuefei_2006@hotmail.com。