中药复方对复合应激致慢性疲劳大鼠认知行为的影响*

张　烨，张振贤，黄　瑶

（1.上海中医药大学附属普陀医院科研处，上海　200062；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内科，上海　200437）

·实验研究·

中药复方对复合应激致慢性疲劳大鼠认知行为的影响*

张烨1，2，张振贤2，黄瑶2

（1.上海中医药大学附属普陀医院科研处，上海200062；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院内科，上海200437）

［目的］观察多重复合应激致慢性疲劳模型大鼠认知行为的变化，验证理虚解郁综合方对其认知的改善作用。［方法］清洁级SD雄性大鼠80只，随机分组为对照组、模型组以及中药低、中、高剂量组，每组16只，除对照组外，均以复合因素造模（慢性束缚、冷水游泳、随机昼夜颠倒），同时中药低、中、高剂量组分以2 mL浓度为0.5、1、2 g/mL中药灌胃30 d，对照组和模型组则给予等体积的生理盐水。造模结束后应用行为学方法（旷场实验、悬尾实验及Morris水迷宫实验）检测不同组大鼠之间出现的差异表现。［结果］与正常组比较，模型组大鼠在水迷宫实验中目标象限停留时间减少，穿越原平台的次数明显减少，旷场中移动距离和移动时间明显减少、而在活动箱边缘区域活动时间百分比增加，悬尾实验中静止时间延长、挣扎次数减少；中药三组与模型组比较，在水迷宫实验中，高剂量组在目标象限内停留的时间有显著增加，各剂量组穿越原平台的次数均明显增加；旷场实验中，中、大剂量组移动时间增加，大剂量组移动距离增加，中剂量组边缘区域活动时间百分比减少；悬尾实验中，中、大剂量组挣扎次数均增加，中剂量组静止时间缩短。［结论］理虚解郁综合方能够明显改善慢性疲劳模型大鼠的认知行为学表现。

中药；动物实验；行为学

慢性疲劳综合征（CFS）是一种以长期极度疲劳为主要症状，同时伴有失眠健忘，肌肉关节疼痛、精神异常的病症［1-2］。伴随现代社会生活节奏的加快和生活压力的增大，CFS的临床发病率呈现明显上升的趋势［3-4］，然其致病机理复杂，与多因素相关，目前尚缺乏有效治疗手段［5］。中药复方“理虚解郁方”长期应用于临床，取得了良好的疗效［6-8］。文章应用行为学评价方法，分析“理虚解郁方”对多重复合应激诱导的慢性疲劳模型大鼠认知行为学的改善作用，为临床用药提供进一步的参考。

1　材料

1．1动物及分组清洁级雄性SD大鼠80只（体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供），按随机数字表法分为5组，分别为：正常对照组、模型组、理虚解郁方（大剂量）、理虚解郁方（中剂量）、理虚解郁方（小剂量），每组16只。

1.2药物及试剂中药：理虚解郁方（由黄芪、党参、仙灵脾、石菖蒲、郁金、景天三七、丹参组成，专利申请号：201210197606.x），每1 mL按低、中、高剂量分别相当于生药0.5、1、2 g，药物委托上海中医药大学附属普陀医院药剂科制备。

1.3主要仪器自制硬塑料束缚筒（直径6 cm，长度40 cm）；大鼠游泳池（75 cm×120 cm×80 cm）；硬质黑色哑光自制敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），Truscan视频追踪分析系统，悬尾测试仪。

2　方法

2.1造模方法本研究采用复合应激建立CFS大鼠模型，采用冷水游泳、慢性束缚及随机昼夜颠倒方法造模，造模时间为30 d。

强制冷水游泳［6，9］：将大鼠每日于随机时间点放入冷水（水温维持在12℃左右）中游泳，每次5～10 min（视大鼠个体游泳能力而定）。

每日慢性束缚［9，13］：用自制束缚筒，将大鼠头向通气口置入后关闭闸门，调节到不产生强烈反抗的紧张程度，每日于随机时间点进行束缚，束缚时长为2～4 h不等。

随机昼夜颠倒［6］：夜间18：00至次日凌晨6：00给予持续日光灯照射，日间放置于黑暗封闭的环境中，共3次，具体时间随机确定。

2.2给药剂量及方法［6］造模前1 min给大鼠灌胃，正常组、模型组予生理盐水2 mL，中药各组予对应剂量中药2 mL，每日1次，共30 d。

2.3观察指标及方法

2.3.1实验期间，每天观察并记录大鼠的进食量、体重、粪便、皮毛色泽及眯眼等情况［6］。

2.3.2行为学指标行为学检测于造模结束后第2天开始进行，首先需将所有要检测的大鼠笼盒放进做行为学测试的房间进行适应性饲养，并由试验人员每日对大鼠进行安抚（handle）以使其适应实验人员的操作和气味，减小对实验的干扰。3 d后进行正式实验。

1）Morris水迷宫［16］：实验在大鼠泳池中进行，水深25 cm，水温（22±2）℃，水中加入白色染料以使水不透明。整个泳池划分为4个象限，目标象限内有可移动的直径12 cm、高23 cm的透明平台，池壁内侧贴有不同形状的标记物。实验第一阶段为训练，将大鼠随机放入水中，让其自由游动，如1 min内找到并爬上平台，等待15 s将其取下；如没有找到则人为引导大鼠至平台并停留15 s后取下。此过程每日重复4次，持续3 d。第二阶段为检测阶段，即第4天先撤去平台，按之前训练顺序，将大鼠放入平台所在象限的对侧象限，由Truscan视频追踪分析系统记录其1 min之内在原平台所在象限内停留的时间和穿越原平台的次数。作为衡量其空间记忆的指标。

2）旷场实验［12］：将大鼠面向角落放入活动箱中，由Truscan系统记录5 min内的移动时间和移动距离，并分析活动轨迹和区域分布；每只大鼠测试结束后需清理活动箱内排泄物，并用10%乙醇擦拭以去除气味。

3）悬尾实验［10-11］：用医用胶布缠绕大鼠尾端靠近中部位置，然后悬挂于装置顶端的张力感受器，设定合适的阈值，记录6 min中大鼠的挣扎情况，取后5 min的大鼠静止不动的时间作为有效数据。

2.4统计学方法采用SIGMAPLOT软件进行统计分析，组间比较采用Student t检验进行检验，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著差异，数据均采用均数±标准差（±s）表示。

3　结果

造模结束后，与正常组相比，可以观察到模型组的大鼠出现体质量下降、食量下降、被毛脱落，活动性下降，对外界刺激反应减弱，大便不成形。一系列“疲劳”样表现初步说明造模成功。

3.1Morris水迷宫实验见表1。水迷宫用于检测大鼠的空间记忆及学习能力。结果提示模型组相较正常组在目标象限中停留的时间有显著的缩短，穿越原平台的次数明显减少；与模型组比较，大剂量中药组停留时间较模型组有所增加，各剂量组穿越原平台次数均增加，尤以大剂量组明显，说明各剂量组理虚解郁方能够缓解慢性疲劳模型大鼠的空间记忆能力的减退，以高剂量组缓解明显。

表1　各组水迷宫目标象限停留时间比较（±s）Tab.1　Comparison of the residence time of target quadrant in morris water maze in each group（±s）

表1　各组水迷宫目标象限停留时间比较（±s）Tab.1　Comparison of the residence time of target quadrant in morris water maze in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组对照，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别　例数　目标象限停留时间（s）　穿越平台次数（次）正常组　16　22.1±4.6　6.51±1.02模型组　16　16.8±2.4*　3.42±1.12*小剂量组　16　16.5±4.2　4.23±1.03#中剂量组　16　15.7±4.4　5.82±1.19#大剂量组　16　18.4±3.9#　6.01±1.12##

3.2旷场实验见表2。旷场实验反映了动物的基础活动量，并能够在一定程度上判断动物的焦虑样情绪。数据表明，模型组相对正常组出现明显的移动距离和移动时间的减少，同时在活动区域上更倾向于在活动箱的边缘区域，说明其焦虑的程度有所增加。而中药组的活动量明显上升，中、大剂量组移动时间增加，大剂量组移动距离增加，并且中剂量组在活动区域上也更倾向于在活动箱的中间区域，说明适当剂量的理虚解郁方除了增加模型大鼠活动性之外，对于焦虑情绪的缓解也能起到一定作用。

表2　各组旷场实验活动时间、距离与区域的比较（±s）Tab.2　Comparison of open field test time，distance and area in each group（±s）

表2　各组旷场实验活动时间、距离与区域的比较（±s）Tab.2　Comparison of open field test time，distance and area in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组对照，#P＜0.05。

组别　例数　移动时间（s） 移动距离（cm） 边缘区域时间（%）正常组　16　232±29　2191±264　87.6±5.2模型组　16　169±22**　1753±388**　96.2±3.3*小剂量组　16　178±19　1664±180　97.4±4.6中剂量组　16　188±25#　1903±261　90.5±2.8#大剂量组　16　206±31#　1984±225#　93.6±6.9

3.3悬尾实验见表3。悬尾实验是经典的评价动物抑郁状态的实验方法之一，利用实验过程中记录动物不动时间和挣扎次数来反映其抑郁状态。实验结果表明，模型组大鼠相较正常组静止不动时间有所增加，挣扎次数减少；中药治疗后，中剂量组较模型组变化明显，表现为静止时间减少、挣扎次数增加，而大剂量组则挣扎次数增加，差异均有统计学意义，说明适当剂量的理虚解郁方能够缓解大鼠的抑郁样情绪。

表3　各组大鼠悬尾中静止时间及挣扎次数比较（±s）Tab.3　Comparison of resting time and struggling frequency of rat tail suspension test in each group（±s）

表3　各组大鼠悬尾中静止时间及挣扎次数比较（±s）Tab.3　Comparison of resting time and struggling frequency of rat tail suspension test in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组对照，#P＜0.05。

组别　例数　静止时间（s）　挣扎次数（次）正常组　16　182.06±21.24　57.24±19.18模型组　16　223.67±13.21*　48.87±21.28*小剂量组　16　197.58±29.61　45.65±23.17中剂量组　16　184.98±32.65#　61.82±17.56#大剂量组　16　209.65±19.26　60.16±22.09#

4　讨论

以往的研究认为，慢性疲劳综合征是由多种因素刺激引起的持续性躯体和精神的双重疲劳，多有负性生活事件等慢性应激源导致。因此，对于模型的建立，也选择多重复合应激方法来模拟人体的多重生理、精神应激状态［13］。慢性束缚通过限制大鼠躯体活动，使其产生反抗、焦躁等行为上的变化；强制冷水游泳包含了体力上的消耗、温度的刺激和强迫心理刺激；随机昼夜颠倒干扰了大鼠正常的昼夜节律，造成体力和精神的双重应激。持续性的多重应激使大鼠同时产生躯体和精神上的疲劳，其变化程度及中药治疗的有效性可以通过相应的行为学指标来评定。

CFS在临床上以身体疲劳为首发症状，逐渐出现心理、认知功能的改变［14-15］，因此在本研究中，选择了Morris水迷宫实验、旷场实验、鼠尾悬挂实验来评价大鼠认知功能的变化［16］。实验利用Morris水迷宫试验检测大鼠记忆力及学习能力的变化［17］。记忆能力下降是慢性疲劳综合征的典型症状之一，检测结果表明，模型组大鼠在目标象限探索的时间明显缩短，穿越原平台次数减少，表明其空间记忆能力的下降，通过中药干预，可使大鼠空间记忆能力下降表现有所改善。旷场实验观察在开放环境中的自主活动和紧张情绪，旷场中模型组大鼠运动时间和运动距离相较正常组都有明显的下降，且在边缘区域的活动时间百分比有所增加，反应了更高程度的情绪紧张。中药能改善大鼠的精神状态，缓解焦虑抑郁等负性情绪，尤以中、大剂量组明显；实验通过悬尾试验评价大鼠抑郁样情绪及身体疲劳状态，数据提示模型组大鼠静止时间明显延长、挣扎次数减少，呈现躯体疲劳及精神抑郁状态，中药中、大剂量能明显缓解大鼠的体力及精神疲劳。

以上结果提示，中药理虚解郁方在适当剂量下，能够对复合应激建立的慢性疲劳大鼠模型认知行为有较明显的疗效，表明其对于大鼠的精神疲劳有较为显著的缓解作用。对于慢性疲劳综合征病因的认识，中医一般认为与先天禀赋不足或劳累过度，情致失调、饮食不节等所致脾虚肝郁［18］、气血失调有关［19-20］。中药复方理虚解郁方兼具补气养血、健脾益气，疏肝解郁透达之疗效，临床上能同时缓解患者的躯体疲劳，同时对于精神症状如抑郁、焦虑等也有不同程度的减轻［7-8］，与本动物实验结论基本一致。另外实验结果表明，理虚解郁方的临床疗效虽并未随着剂量的增加而呈现递增趋势，但却能在一定程度上同时缓解躯体及精神疲劳症状，故临床中值得进一步推广运用，其作用机制也值得进一步探讨。

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（本文编辑：马英，张震之）

Intervention effects of Chinese herbal compounds on the behavior of chronic fatigue rats induced by combined stress

ZHANG Ye1，2，ZHANG Zhen-xian2，HUANG Yao2
（1.Scientific Research office，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；2.Medical Department，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medcine，Shanghai 200437，China）

［Objective］To observe the changes of behavior of chronic fatigue rats induced by combined stress，and to verify the effect of Lixu Jiyu recipe on the improvement of behavior.［Methods］The 80 SD male rats were randomly divided into 5 groups：control group，model group，low dose treated group，middle dose treated group，and high dose treated group，16 rats in each group.The CFS rats models were made with multiple stimuli including chronic restraint，Swimming in cold water and day and night reversed by randomly except control group.The rats in the control group and model group were given normal saline of 2 mL，and the treated groups were given concentration of 0.5，1，2 g/mL of Lixu Jieyu recipe for 30 days.To observe the rats’behavioristic changes in open-field test，tail hanging test，exhausting swimming test and morris water maze test among different groups.［Results］Compared with the control group，the model group manifested a series of abnormal variations in open-field test，tail hanging test.Compared with the model group，Lixu Jieyu recipe could improve moving time and distance in open-field test，reducing the percentage of active time of the marginal zone；increasing the times of struggle，shortening the time of rest in tail hanging test；prolonging the time of the rats in the target quadrant in Morris water maze test.［Conclusion］Lixu Jieyu recipe can significantly improve the behavior of rats with chronic fatigue.

traditional Chinese Medicine；animal experiment；behavioristics

R259

A

1672-1519（2016）09-0545-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.10

2016-05-20）

国家自然科学基金青年项目（81303099）；上海市杏林新星计划（ZY3-RCPY-2-2015）。

张烨（1982-），女，硕士，主治医师，主要从事中医亚健康、中医心血管方面的研究。