超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中精氨酸及衍生物含量

田　晔，江　骥，胡　蓓，薛金萍，王洪允

(1.福州大学化学学院，福建省功能材料工程研究中心，福建省光动力治疗药物与诊疗工程技术研究中心，福建 福州　350108；2.中国医学科学院北京协和医院临床药理中心，北京　100730)



超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中精氨酸及衍生物含量

田晔1,2，江骥2，胡蓓2，薛金萍1，王洪允2

(1.福州大学化学学院，福建省功能材料工程研究中心，福建省光动力治疗药物与诊疗工程技术研究中心，福建 福州350108；2.中国医学科学院北京协和医院临床药理中心，北京100730)

建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定使用艾普拉唑后人血浆中二甲基精氨酸(ADMA)、对称二甲基精氨酸(SDMA)、单甲基精氨酸(NMMA)、瓜氨酸(Cit)和L-精氨酸(L-Arg)的浓度。采用HILIC亲水相互作用色谱和非衍生化的蛋白沉淀法进行分离分析，色谱柱选取Waters Atlantic HILIC柱(2.1 mm×50 mm×3 μm)，流动相由乙腈(含0.5%乙酸和0.025%三氟乙酸)-水(含0.5%乙酸和0.025%三氟乙酸)(85∶15,V/V)组成，流速0.25 mL/min。采用多反应离子监测(MRM)模式，以电喷雾离子源(ESI)正离子方式检测。结果显示，ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit的线性关系良好，相关系数r均大于0.994 0；ADMA、SDMA和NMMA的线性范围为0.1～5 mmol/L，L-Arg和Cit的线性范围为10～250 mmol/L；5种氨基酸的日内、日间精密度均小于15%，准确度在85%～115%之间。该方法快速、简便、灵敏，可为相关疾病的临床诊断提供一种高效的检测手段。

超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)；艾普拉唑；蛋白沉淀法；亲水性色谱

一氧化氮是人体重要的信使分子，L-精氨酸(L-Arg)在一氧化氮全酶(NOS)的催化下，产生一氧化氮(NO)和瓜氨酸(Cit)[1-2]。蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTS)以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，可使各种多肽中的L-精氨酸残基甲基化，甲基化的蛋白质水解后即可产生甲基化的精氨酸，此过程产生了不对称二甲基精氨酸(ADMA)，单甲基精氨酸(NMMA)和对称二甲基精氨酸(SDMA)，其关系示于图1[3]。ADMA是NOS的内源性竞争抑制剂，通过抑制NOS的活性，从而抑制NO的产生[4-6]；研究表明，使用质子泵抑制剂(PPIs)可提高ADMA的水平，从而增加心血管不良事件的发生率[7]。虽然NMMA也可以抑制NO的产生，但其在人体中的含量远远低于ADMA。SDMA不直接抑制NO的合成，但可与内皮细胞膜上的阳离子氨基酸转运体竞争，从而加剧精氨酸的缺乏[8]；另有研究表明，SDMA可作为肾功能和缺血性中风所引起死亡的新型标记物[9]。

图1　ADMA，SDMA，NMMA，Cit和L-Arg的关系Fig.1　Relationship of ADMA, SDMA, NMMA, Cit and L-Arg

目前，检测氨基酸含量常用的方法有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、电泳法(EC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC/MC)、氨基酸分析仪法等[10-12]。近年来，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法在生物医学和药物研究领域的应用发展迅速。

根据ADMA、SDMA、NMMA、Cit 和L-Arg之间的关系，本工作拟选用强极性和强亲水性的 HILIC色谱柱，采用UPLC技术进行色谱分离，以电喷雾离子源正离子方式和多反应离子扫描模式测定人服用PPIs后，血浆中ADMA、SDMA、NMMA、Cit 和L-Arg的浓度，希望为相关疾病的临床诊断提供方法参考。

1　实验部分

1.1主要仪器与装置

Acquity UPLC超高效液相色谱仪，Xevo TQS三重串联四极杆质谱仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源及MassLynx 4.0数据处理系统；低温高速离心机和涡流混合器：德国Heraeus公司产品；纯水机：美国Milli-Q公司产品；AX240十万分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司产品；WinNonlin软件Version 6.3：美国Pharsight 公司产品。

1.2主要材料与试剂

ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg标准对照品：美国Sigma公司产品，其结构列于表1；D7-ADMA内标对照品：美国Cambridge Isotope公司产品；乙腈(色谱纯)：美国Honeywell Burdick & Jackson公司产品；乙酸(色谱纯)：美国Fisher Scientific公司产品；三氟乙酸(TFA，色谱纯)：百灵威科技有限公司产品；实验用水：由Milli-Q纯化系统制备；空白血浆：由北京协和医院血库提供。

1.3实验条件

1.3.1色谱条件色谱柱：Waters Atlantic HILIC柱(2.1 mm×50 mm×3 μm)；流动相：乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)-水(含0.5%乙酸和0.025%TFA)(85∶15,V/V)；流速：0.25 mL/min；进样体积：10 μL。

1.3.2质谱条件电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；毛细管电压3 kV；锥孔电压50 V；锥孔气流速150 L/h；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气流速650 L/h；碰撞气为氩气；以多反应监测(MRM)扫描方式进行测定，详细的质谱参数列于表1。

表1　L-Arg、Cit、ADMA、SDMA和NMMA的MRM参数

1.4血浆样品的测定

1.4.1标准曲线和质控血浆样品的测定取20 μL空白血浆，加入20 μL待测化合物工作液和10 μL 10 mg/L内标工作液，涡旋振荡20 s；随后加入160 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)，再涡旋振荡3 min，以13 000 r/min离心10 min后，取上清液，进样测定，进样体积10 μL。

1.4.2实际血浆样本的测定取20 μL实际血浆样品，加入20 μL纯水和10 μL 10 mg/L内标工作液，涡旋振荡20 s；随后加入160 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)，再涡旋振荡3 min，以13 000 r/min离心10 min后，取上清液，进样测定，进样体积10 μL。

1.5方法学考察

参照美国食品药品监督管理局(FDA)在2013年颁布的指导原则[13]，对本方法的标准曲线线性，准确度和日内、日间精密度，萃取回收率和基质效应进行考察。

2　结果与讨论

2.1色谱分析

空白样品中，除不加内标外，其他按1.4节条件进行分析，因L-Arg、Cit、ADMA、SDMA、NMMA均为内源性氨基酸，故在空白血浆中均有检出，其质量色谱图示于图2。可见，L-Arg、Cit、ADMA、SDMA和NMMA的保留时间分别为0.96、0.95、0.96、0.95和0.96 min，色谱峰形良好。

2.2标准曲线线性和方法定量限

按照1.4.1节方法制备并测定血浆标准曲线样品，ADMA、SDMA和NMMA的标准曲线浓度点依次为0.1、0.25、0.5、1、2、4和5 mmol/L；L-Arg和Cit的标准曲线浓度点依次为10、25、50、100、200、400和500 mmol/L。由于ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit均属于内源性物质，故每批制备5个BK(只含内标不含化合物的样品)，分别计算出5个BK中5种氨基酸的峰面积，并将其与内标峰面积之比的均值作为空白本底。以ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit浓度为横坐标，以5种氨基酸峰面积与内标峰面积之比减去空白本底为纵坐标，权重系数1/x2，进行线性回归，得到的回归方程列于表2。

2.3准确度和日内、日间精密度

按照1.4.1节方法制备并测定低、中、高3种浓度的质控样品，低浓度质控样品中，ADMA、SDMA和NMMA的浓度均为0.3 mmol/L，Cit和L-Arg的浓度均为25 mmol/L；中浓度质控样品中，ADMA、SDMA和NMMA的浓度均为2.5 mmol/L，Cit和L-Arg的浓度均为250 mmol/L；高浓度质控样品中，ADMA、SDMA和NMMA的浓度均为4 mmol/L，Cit和L-Arg的浓度均为400 mmol/L。每个浓度平行测定5个样品，连续测定3天，计算准确度和日内、日间精密度，结果列于表3。

2.4萃取回收率

2.4.1萃取样品取20 μL血浆样品，加入20 μL待测化合物工作液(低、中、高浓度的质控样品，n=6)，涡旋振荡20 s，随即加入160 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)，按1.4节方法制备并测定。

2.4.2未萃取样品配制与2.3节相同的低、中、高3种浓度的质控样品(溶剂为乙腈，含0.5%乙酸和0.025%TFA)，取空白血浆，按照1.4节方法处理，取180 μL上清液，加入20 μL标准溶液，涡旋振荡并测定(每一浓度平行测定6个样品，共18个)。

将萃取样品与相同浓度未萃取样品的峰面积进行比较，计算ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的萃取回收率分别为：(92.5±8.6)%、(88.5±6.5)%、(50.6±3.1)%、(27.0±0.3)%和(33.9±2.1)%。

2.5基质效应

配制与2.3节相同的低、中、高3种浓度的质控样品(溶剂为乙腈，含0.5%乙酸和0.025%TFA)。取6份来自不同个体的空白血浆，按1.4节方法处理，取180 μL上清液，加入20 μL标准溶液，涡旋振荡并测定(每一浓度测定6个样品，共18个)；将180 μL乙腈(含0.5%乙酸和0.025%TFA)加入 20 μL标准溶液中，直接测定获得的峰面积，计算基质效应。ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的基质效应分别为：(90.5±6.3)%、(83.0±3.5)%、(50.6±2.5)%、(41.0±0.1)%和(32.9±0.2)%。

图2　空白血浆(a)，空白血浆中加入内标(b)和受试者服药2 h后(c)的典型质量色谱图Fig.2　Typical MRM chromatograms of double blank plasma (a), blank plasma spiked with IS (b) and a subject plasma sample after 2 h post-dose (c)

化合物线性方程相关系数(r)定量限/(mmol/L)线性范围/(mmol/L)ADMAy=0.3851x+0.20770.99670.10.1～5SDMAy=0.4180x+0.20070.99830.10.1～5NMMAy=0.3662x+0.048310.99850.10.1～5L-Argy=0.01153x+1.20490.99801010～500City=0.04321x+8.31540.99411010～500

表3　ADMA，SDMA，NMMA，L-Arg和Cit的准确度和日内、日间精密度

2.6方法应用

艾普拉唑是一种质子泵抑制剂，在十二指肠溃疡患者中多次给药试验后，检测体内ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的浓度变化。选取10名十二指肠溃疡患者进行随机、开放、平行、阳性药对照试验，给药剂量20 mg，于第1天早晨静脉输注，采集给药后25 min、45 min、55 min、1.5 h、2 h、3 h、5 h、8 h、12 h和24 h共计11个采血点的系列血样。采用UPLC-MS/MS法测定10名受试者的系列血样，得到的平均血药浓度-时间曲线示于图3。结果表明，在短时间内，使用高剂量的PPIs，体内ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的浓度并没有发生明显的改变。

图3　十二指肠溃疡患者静脉注射20 mg艾普拉唑后，ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的平均血药浓度-时间曲线(n=10)Fig.3　Mean plasma concentration-time curves of ADMA, SDMA, NMMA, Cit and L-Arg in duodenal ulcer patients intravenous PPIs 20 mg (n=10)

2.7讨论

本工作建立了同时测定血浆中ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit浓度的UPLC-MS/MS方法，鉴于以上5种氨基酸水溶性较强，且有一定的极性，因此采用ESI+模式进行测定。实验选择了HILIC亲水相互作用色谱柱，因其可为强极性和强亲水性化合物提供合适的保留，通过优化多个色谱参数，有利于实现目标组分和基质中干扰物质的分离，从而降低基质效应的影响；又因其流动相中含高比例水溶性有机相，有利于提高质谱的离子化效率和分析灵敏度。实验选择蛋白沉淀法或固相萃取法进行样品前处理，因固相萃取法价格昂贵，技术要求高，操作步骤繁琐，故采用了既能满足要求，操作又相对简单的蛋白沉淀法，即加入沉淀剂，直接取上清液进样。此外，分析过程中氘代同位素内标的使用有效地提高了本方法的准确性和适用性。

本实验对10名十二指肠溃疡患者服用艾普拉唑后的血样进行药代动力学分析，结果发现，使用艾普拉唑并未造成体内ADMA、SDMA、NMMA、Cit和L-Arg的浓度水平发生明显的变化，说明人体在使用艾普拉唑后，不会增加心血管不良事件的发生率，此结论在Ghebremariam等[14]研究兰索拉唑与心血管疾病的关系时得到证实。

3　结论

本工作建立了同时测定血浆中ADMA、SDMA、NMMA、L-Arg和Cit浓度的UPLC-MS/MS方法，可实现5种氨基酸在3.0 min内的快速检测。该方法采用HILIC亲水相互作用色谱和非衍生化的蛋白沉淀法，具有快速、简便和灵敏的优点，可为今后相关疾病的临床诊断提供一种高效的检测手段。

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Determination of Amino Acid Biomarkers in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TIAN Ye1,2, JIANG Ji2, HU Pei2, XUE Jin-ping1, WANG Hong-yun2

(1.FujianEngineeringResearchCenterforDrugandDiagnoses-TreatofPhotodynamicTherapy,CollegeofChemistry,FuzhouUniversity,Fuzhou350108,China;2.ClinicalPharmacologyResearchCenter,PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100730,China)

An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of ADMA, SDMA, NMMA,L-Arg and Cit in human plasma after administration of ilaprazole. The plasma samples were prepared using protein precipitation by acetonitrile after addition of deuterated internal standard. The analytical column was Waters Atlantic HILIC (2.1 mm×50 mm×3 μm), and the mobile phase was composed of acetonitrile (containing 0.5% acetic acid and 0.025% trifluoroacetic acid)-water (containing 0.5% acetic acid and 0.025% trifluoroacetic acid) (85∶15,V/V). The flow rate was 0.25 mL/min and the sample run time was 3.0 min. A tandem mass spectrometer coupled with positive electro-spray ionization (ESI) source was used for detection. The quantitative analysis was performed on selective ion chromatograms acquired by a multiple reaction monitoring (MRM) mode of following transitions: ADMA (m/z203.2→46.0), SDMA (m/z203.2→172.1), NMMA (m/z189.0→70.0), Cit (m/z176.0→70.0),L-Arg (m/z175.1→60.071), and D7-ADMA (m/z210.0→77.1). The specificity, accuracy, linearity, intra-day and inter-day precision, recovery and matrix effect were investigated in this study according to the guidance issued by the Food and Drug Administration (FDA) of USA. The method was validated over the concentration range of 0.1-5 mmol/L for ADMA, SDMA and NMMA, 10-250 mmol/L forL-Arg and Cit, respectively. Inter-day and intra-day precision were less than 15% and accuracy was within 85%-115%. The linear regression (weighed by 1/x2) was applied to establish the relationship between plasma concentration and peak area ratio of each analyte (minus that of the blank) to its IS. Topical equations of ADMA, SDMA, NMMA,L-Arg and Cit were as follows:y=0.385 1x+0.207 7 (r=0.996 7),y=0.418 0x+0.200 7 (r=0.998 3),y=0.366 2x+0.048 31(r=0.998 5),y=0.011 53x+1.204 9 (r=0.998 0), andy=0.043 21x+8.315 4 (r=0.994 1), respectively. The extraction recoveries of ADMA, SDMA, NMMA, Cit andL-Arg were (92.5±8.6)%, (88.5±6.5)%, (50.6±3.1)%, (27.0±0.3)% and (33.9%±2.1)%, respectively. The matrix effects about ADMA, SDMA, NMMA, Cit andL-Arg were (90.5±6.3)%, (83.0±3.5)%, (50.6±2.5)%, (41.0±0.1)%, and (32.9±0.2)%, respectively. Therefore, this method is rapid, simple and sensitive, and which can provide a highly efficient detection means to the future clinical disease diagnosis.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); ilaprazole; protein precipitation; hydrophilic chromatography (HILIC)

2015-12-29;

2016-03-01

田晔(1988—)，女(汉族)，河南周口人，硕士研究生，从事药代动力学研究。E-mail: tianye504@163.com

王洪允(1975—)，男(满族)，辽宁抚顺人，副研究员，从事药代动力学研究。E-mail: wanghy@pumch.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0446-07

10.7538/zpxb.youxian.2016.0036

网络出版时间：2016-07-05；网络出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1020.004.html