基于液相色谱-质谱的代谢组学方法研究卷柏治疗高尿酸血症大鼠的作用机制

徐　晨，陈维佳，于江洪，刘　舒，刘志强，宋凤瑞

(1.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春　130022；2.吉林大学药学院，吉林 长春　130021；3.吉林省东北亚药业股份有限公司，吉林 敦化　133700)



基于液相色谱-质谱的代谢组学方法研究卷柏治疗高尿酸血症大鼠的作用机制

徐晨1，陈维佳2，于江洪3，刘舒1，刘志强1，宋凤瑞1

(1.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春130022；2.吉林大学药学院，吉林 长春130021；3.吉林省东北亚药业股份有限公司，吉林 敦化133700)

采用基于超高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-QTOF/MS)的代谢组学方法研究卷柏治疗高尿酸血症大鼠的作用机制，运用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)方法对健康对照组、高尿酸血症模型组和卷柏组的大鼠尿液中内源性代谢物进行分析，寻找卷柏治疗高尿酸血症大鼠的潜在生物标记物。结果表明，经PCA和OPLS-DA分析后，健康对照组、高尿酸血症模型组和卷柏组的大鼠尿液代谢物谱能得到有效地区分；发现并鉴定了9个潜在生物标记物，分别为尿酸、尿囊素、黄尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、马尿酸、肌酐、富马酸和柠檬酸。卷柏对高尿酸血症大鼠的治疗主要体现为对嘌呤代谢、色氨酸代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢以及苯丙氨酸代谢的调节作用。同时，通过检测血清生化指标，表明卷柏能降低高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，并起到保护肾脏的作用。

代谢组学；卷柏；高尿酸血症；液相色谱-质谱

高尿酸血症是由于嘌呤代谢紊乱导致血尿酸升高的一种疾病，其诊断标准为血尿酸浓度男性高于7.0 mg/dL，女性高于6.0 mg/dL[1]。高尿酸血症与内皮功能紊乱、心血管疾病及肾脏疾病等密切相关[2-5]。该病多发于中年男性，但是近年来，随着人们生活方式和饮食结构的改变，年轻人和绝经女性的患病率逐渐增高[6]。

目前，从天然资源中寻找治疗高尿酸血症的药物已成为药学研究的热点。其中，以黄嘌呤氧化酶为靶点，筛选抗痛风中药是现行的主流方法，并且取得了很好的研究进展。有研究表明，卷柏(Selaginellatamariscina(P. Beauv.)Spring)双黄酮提取物能够明显的抑制黄嘌呤氧化酶的活性[7-8]，但关于卷柏治疗高尿酸血症的整体作用机制尚无报道。

代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后，以其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体系代谢途径的一门科学[9]。该学科发展迅速，现已广泛应用于疾病诊断、药物研发、药物治疗、毒性评价等领域[10-13]。液相色谱-质谱(LC/MS)联用技术，特别是超高效液相色谱-质谱(UPLC/MS)联用技术，因具有较高的灵敏度和分辨率，以及较宽的动态范围，而被广泛用于代谢组学研究。

本研究拟采用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-ESI-QTOF/MS)检测经卷柏治疗的高尿酸血症大鼠尿液中代谢物的变化，通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)寻找潜在的生物标记物，并由此探索卷柏的作用机制。

1　实验部分

1.1主要仪器

Waters Synapt G2四极杆飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品，配有Acquity UPLC系统、ESI电喷雾离子源；Centrifuge 5810R超速冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品。

1.2主要试剂

黄嘌呤：美国Sigma公司产品；氧嗪酸钾：成都西亚试剂有限公司产品；HE染色(苏木精-伊红染色法)相关试剂：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；Masson染色(马松三色染色法)试剂盒：南京建成生物研究所产品；卷柏：北京同仁堂制药有限公司产品；尿酸、尿囊素、黄尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、马尿酸、肌酐、富马酸和柠檬酸标准品：均为美国Sigma公司产品。

1.3卷柏提取物的制备

卷柏粉碎，过60目筛后，加入10倍质量的水，浸润40 min，然后回流提取40 min；过滤出滤液后，再加入10倍质量的水，回流提取40 min；合并2次滤液，于50 ℃旋转蒸发浓缩后，冻干；冻干粉加水溶解后使用。

1.4动物实验

18只Wistar大鼠(体重200～250 g)，购于吉林大学实验动物中心，适应环境7天后，随机分成3组：1) 健康对照组(HCG)：连续13天按照0.5 mL/100 g体重腹腔注射生理盐水，每日2次；2) 高尿酸血症模型组(MG)：连续13天按照0.5 mL/100 g体重腹腔注射造模药(黄嘌呤和氧嗪酸钾均为60 g/L的混合液)，每日2次；3) 卷柏组(STG)：连续13天按照0.5 mL/100 g体重腹腔注射造模药(黄嘌呤和氧嗪酸钾均为60 g/L的混合液)，每日2次，从第4天开始，按照320 mg/100 g体重灌胃给药卷柏提取物，一日1次，连续10天。

1.5样品收集与制备

在实验第13天收集大鼠的18 h尿液，以10 000 r/min离心10 min，取上清液，冷冻贮藏于-80 ℃冰箱中。样品检测前，在4 ℃冰箱中解冻尿液样品，经0.22 μm滤膜过滤，取上清液，用超纯水以1∶10(V/V)稀释，供UPLC-ESI-QTOF/MS测定。

在实验第3天，取大鼠眼眶血，备用；第14天，处死大鼠，取血液；2次所得的血液均以4 000 r/min离心10 min，取上清液作为血清储备液，冷冻贮藏于-80 ℃冰箱中。

1.6实验条件

1.6.1色谱条件Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)；流动相：A为0.1%甲酸-水溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～5 min、5%B～20%B，5～8 min、20%B～50%B，8～10.5 min、50%B～100%B；流速0.4 mL/min；进样室温度4 ℃；柱温35 ℃；进样量5 μL。

1.6.2质谱条件Waters Synapt G2四极杆飞行时间质谱仪，正离子模式毛细管电压2.5 kV，负离子模式毛细管电压2.0 kV，锥孔电压40 V，萃取锥电压2.0 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气流速50 L/h，脱溶剂气流速800 L/h，质量扫描范围m/z100～1 000，碰撞能量10～40 eV。测样前，使用甲酸钠进行校正，采用分辨率模式；测样时，采用2 μg/L亮氨酸脑啡肽实时校正，15 s校正1次，每次采集亮氨酸脑啡肽信号0.5 s，亮氨酸脑啡肽进样流速5 μL/min。

1.7数据处理

样品经UPLC-ESI-QTOF/MS检测获得原始数据，采用Markerlynx XS v4.1软件进行峰检测、峰对齐以及归一化。以精确分子质量-保留时间和归一化后的峰面积建立数据矩阵，数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P(Umetrics, Umeå, Sweden)中进行PCA和OPLS-DA多元变量分析。使用生物学数据库，如HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)、METLIN (http:∥metlin.scripps.edu/)、Massbank(http:∥www.massbank.jp/)和KEGG(http:∥www.kegg.com/)进行生物标记物的鉴定和代谢通路的分析。

1.8血清生化指标及肾组织切片检测

大鼠血清中尿酸及肌酐的含量测定采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(UPLC-TQ-MS)，具体实验步骤参见文献[14]。

2　结果与讨论

2.1血清生化指标检测

血清生化指标检测结果列于表1。可以看出：在实验第3天，模型组和卷柏组的血尿酸含量显著升高，表明高尿酸血症模型成功建立；在第14天，即经过10天的卷柏给药，卷柏组的血尿酸含量相对模型组降低，表明卷柏具有降低高尿酸血症大鼠血尿酸的作用。通常，血清肌酐含量可作为衡量肾脏功能的指标，在第14天，模型组血清肌酐含量与健康组相比升高，表明模型组大鼠的肾脏功能受损，而卷柏组大鼠的血清肌酐含量相对模型组降低，说明卷柏具有保护肾脏的作用。

2.2尿液代谢物谱分析和潜在生物标记物鉴定

采用UPLC-ESI-QTOF/MS法进行尿液样品的分离和数据采集，并对数据进行PCA和OPLS-DA分析，PCA在正离子模式和负离子模式下的得分图示于图1。可以看出，健康对照组、模型组和卷柏组能完全分开，表明这3组大鼠的尿液代谢物谱发生了明显变化。为了更好的区分并找到影响分组的代谢物，采用OPLS-DA法研究模型组和卷柏组大鼠的代谢物谱差异。

表1　血清尿酸和血清肌酐的浓度(平均值±SD,n=6)

注：*表示与模型组相比P<0.01；**表示与模型组相比P<0.05

图1　健康对照组、模型组和卷柏组在正离子模式(a)和负离子模式(b)下的PCA得分图Fig.1　PCA score plots of HCG, MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

OPLS-DA在正离子模式和负离子模式下的得分图分别示于图2，可以看出，模型组和卷柏组有明显区别，经卷柏给药后大鼠的代谢状况发生了明显改变。模型组和卷柏组在正离子模式和负离子模式下的S-plot示于图3，每个点表示1个化合物，离原点距离越远表示这个化合物对模型组和卷柏组大鼠分组的贡献越大。选择VIP值大于1的代谢物为潜在生物标记物，共找出了对模型组和卷柏组分类贡献较大的9个化合物，即卷柏治疗高尿酸血症大鼠的潜在生物标记物。根据质荷比和串联质谱数据，并与标准品和数据库进行比较，鉴定出9个潜在生物标志物，结果列于表2。以负谱m/z212.002 7代谢物为例说明鉴定过程：首先，准分子离子峰的质荷比为212.002 7，经计算其化学式为C8H7NO4S，此代谢物初步鉴定为硫酸吲哚酚；由串联质谱图可知，此代谢物有2个碎片离子m/z132.05和m/z79.96，经计算，这2个碎片离子分别为[M—H—SO3]-和[SO3]-；综上，鉴定此代谢物为硫酸吲哚酚。

图2　模型组和卷柏组在正离子模式(a)和负离子模式(b)下的OPLS-DA得分图Fig.2　OPLS-DA score plots of MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

Fig.3　模型组和卷柏组在正离子模式(a)和负离子模式(b)下的S-plotFig.3　S-plots of OPLS-DA for MG and STG in positive ion mode (a) and negative ion mode (b)

模式VIP值化合物分子式测定质荷比m/z理论质荷比m/z误差/10-6串联质谱变化趋势*变化趋势**变化倍数*变化倍数**正离子1.34肌酐C4H7N3O114.0663114.0662+0.8844.10上调下调2.061.942.52黄尿酸C10H7NO4206.0443206.0448-2.43160.04上调下调1.741.842.04马尿酸C9H9NO3180.0658180.0655+1.67105.05,上调下调1.791.6777.022.21犬尿酸C10H7NO3190.0500190.0499+0.53144.05,上调下调1.931.71116.061.16尿囊素C4H6N4O3159.0511159.0513-1.2661.04,上调下调2.482.0399.03负离子5.17硫酸吲C8H7NO4S212.0027212.0023-1.89132.05,上调下调4.942.69哚酚79.962.27柠檬酸C6H8O7191.0200191.0197+1.57111.01下调上调1.511.285.57尿酸C5H4N4O3167.0214167.0211+1.80124.02,上调下调3.011.8996.02,69.011.12富马酸C4H4O4115.0036115.0037-0.8771.10下调上调1.471.68

注：*为模型组vs健康对照组，P<0.05；**为卷柏组vs模型组，P<0.05

2.3卷柏治疗高尿酸血症大鼠作用机制分析

实验表明，卷柏给药组大鼠尿液中的尿酸含量明显降低，说明卷柏有降低尿酸的作用。尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，但大鼠体内存在将尿酸氧化为尿囊素的尿酸酶。本研究采用氧嗪酸钾抑制尿酸酶活性来造模，但是尿酸能够通过非酶途径被氧化为尿囊素，因此尿囊素含量的变化也代表了尿酸含量的变化。

黄尿酸、犬尿酸以及硫酸吲哚酚是色氨酸代谢通路的重要代谢物。已有研究[15-16]表明，在肾功能不全的大鼠体内，黄尿酸和犬尿酸的含量会升高。硫酸吲哚酚是吲哚酚的二相代谢产物，其在慢性肾病大鼠血清中明显升高[17]。在本研究中，黄尿酸、犬尿酸以及硫酸吲哚酚在模型组中含量升高，除此以外，与肾损伤有关的标记物，包括精氨酸和脯氨酸代谢通路的肌酐和苯丙氨酸代谢通路的马尿酸也都在模型组中上调。这些代谢物含量的变化都表明，模型组大鼠具有肾脏损伤。在卷柏组，这些与肾脏功能相关的代谢物含量都下调，表明卷柏能够起到保护肾脏的作用。

富马酸和柠檬酸是三羧酸循环的重要中间物。三羧酸循环是能量代谢的重要组成部分，是能量物质(如糖、脂肪酸和氨基酸)氧化的途径。在模型组中，富马酸和柠檬酸含量降低，说明高尿酸血症大鼠体内能量代谢异常；在卷柏组中，富马酸和柠檬酸含量相比模型组均有上调，表明卷柏能够调节高尿酸血症大鼠的能量代谢。

3　结论

本研究采用基于UPLC-ESI-QTOF/MS的代谢组学方法研究了卷柏治疗高尿酸血症大鼠的尿液代谢谱变化，并检测了大鼠的血清生化指标。结果表明，卷柏调节了高尿酸血症大鼠的9个代谢物，包括尿酸、尿囊素、黄尿酸、犬尿酸、硫酸吲哚酚、马尿酸、肌酐、富马酸和柠檬酸，这些潜在生物标志物的变化趋势反映了卷柏在嘌呤代谢、色氨酸代谢、三羧酸循环、精氨酸和脯氨酸代谢以及苯丙氨酸代谢的调节作用。

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Metabonomics Study ofSelaginellatamariscinafor Hyperuricemia in Rats Using UPLC-ESI-QTOF/MS

XU Chen1, CHEN Wei-jia2, YU Jiang-hong3, LIU Shu1, LIU Zhi-qiang1, SONG Feng-rui1

(1.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China;2.SchoolofPharmaceuticalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China;3.JilinNortheastAsiaPharmaceuticalCo.,Ltd.,Changchun133700,China)

A urinary metabonomics method based on ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadruple time-of-flight/mass spectrometry (UPLC-ESI-QTOF/MS) was developed to study the effects ofSelaginellatamariscinaon hyperuricemic rats. Principal components analysis (PCA) and orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) were applied to analyze the metabolites in healthy control group (HCG), model group (MG) andSelaginellatamariscina-treated group (STG). The results show that significant differences in urinary metabolic profiles are observed from HCG, MG and STG by using PCA and OPLS-DA. And nine potential biomarkers including uric acid, allantoin, xanthurenic acid, kynurenic acid, indoxyl sulfate, hippuric acid, creatinine, fumaric acid and citric acid are found. Pathways of purine metabolism, tryptophan metabolism, tricarboxylic acid cycle, arginine and proline metabolism and phenylalanine metabolism are in response to the therapeutic effects ofSelaginellatamariscina. Besides, the serum biochemical analysis demonstrated thatSelaginellatamariscinacan not only reduce the amount of uric acid but also protect the kidney of hyperuricemic rat.

metabonomics;Selaginellatamariscina; hyperuricemia; LC/MS

2015-09-28;

2015-11-09

国家自然科学基金项目(21175128，81303280)资助

徐晨(1988—)，女(汉族)，河南焦作人，博士研究生，药物分析专业。E-mail: xuchen214@126.com

刘舒(1985—)，女(汉族)，山东菏泽人，副研究员，从事质谱分析研究。E-mail: mslab20@ciac.ac.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0440-06

10.7538/zpxb.youxian.2016.0018

网络出版时间：2016-03-28；网络出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.020.html