番茄自交系YNAU335对番茄斑萎病毒抗性的鉴定

莫云容　张培欣　邓明华　杨正安　朱海山　张　宏　汤晓倩　文　玲　马仲飞　赵　凯*

（1云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201；2东川区经济作物技术推广站，云南东川 654100；3昭通市昭阳 区园艺技术推广所，云南昭通 657000）

番茄自交系YNAU335对番茄斑萎病毒抗性的鉴定

莫云容1张培欣1邓明华1杨正安1朱海山1张宏1汤晓倩1文玲2马仲飞3赵凯1*

（1云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201；2东川区经济作物技术推广站，云南东川 654100；3昭通市昭阳 区园艺技术推广所，云南昭通 657000）

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）已成为近年来危害番茄生产的重要病害，鉴定和选育抗病品种是防治TSWV的有效途径。选取自主培育和引进的番茄品种（系），经过连续3 a的大棚蓟马传毒和光照培养箱人工接种试验，鉴定番茄品种（系）对TSWV的抗性。结果表明，番茄自交系YNAU335对TSWV表现为免疫，其他品种全部表现为感病，而且在YNAU335人工接种和大田蓟马传毒叶片中并未克隆出TSWV核衣壳蛋白基因和小片段 RNA 3′ 端序列，而在其 他感病品种（系）中均克隆出这2段序列。研究结果初步确定番茄自交系YNAU335为TSWV抗病品系，可作为T SWV抗病育种的番茄资源。

番茄；番茄斑萎病毒；抗病育种；核衣壳蛋白基因；抗性鉴定

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是番茄斑萎病毒属（Tospovirus）中最重要的一种病毒，该病毒寄主范围广泛，可侵染100多个科1 100多种单、双子叶植物，而且多种茄科园艺作物为TSWV的寄主（方琦等，2011；邱树克等，2012；孙书娥等，2014；王立浩等，2016）。澳大利亚最早发现TSWV，随着传播介体西花蓟马的扩散，TSWV在世界大多数国家传播，并给当地番茄生产造成严重损失，已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一（张仲凯等，1998；唐前君等，2010；曹金强等，2016）。种植者试图通过物理、化学和生物的方法控制蓟马来间接防治TSWV，但并不能有效抑制病毒的传播（Soler et al.，2003）。目前防治TSWV经济、绿色、有效的方法是培育TSWV抗病品种（Gordillo & S tevens，2008）。

抗TSWV的番茄资源主要分布在秘鲁番茄和智利番茄等野生番茄中，这两类番茄对TSWV的抗性分别由不同的质量抗病基因控制（Stevens et al.，1991；Gordillo & Stevens，2008）。利用抗病品种中质量抗病 基因及连锁的分子标记，国外研究者已选育出一系列T SWV抗病品种（Aramburu et al.，2010；Lopez et al.，2011）。由于抗病基因对TSWV有株系特异性，国外抗病品种对国内TSWV并不一定有抗性。因此，选育适合国内TSWV抗病品种的工作显得迫切而重要。

1　材料与方法

1.1试验田概况

试验大棚位于云南农业大学教学实验农场蔬持认知中心，棚内、棚外于2013年和2014年连续两年发生TSWV。

1.2试验材料与试剂

供试材料为云南农业大学园林园艺学院番茄辣椒课题组选育的品种（系）6份：5号自交系、YNAU335自交系、云杂8号、云抗1号、滇番茄23号、滇番茄26号；引自亚洲蔬持研究发展中心的自交系1份：CLN2037E。TSWV株系为YNAU2015。

RNA提取试剂盒购于北京华越洋生物科技有限公司，CDNA反转录试剂盒（货号：RR047A）和PCR高保真酶PrimeSTARmaxdNA Polymerase（货号：R045A）购于宝生物工程（大连）有限公司，克隆载体pEASY_Blunt Cloning VeCtor购于北京全式金生物技术有限公司，PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3试验方法

1.3.1RNA的提取及反转录 番茄叶片总RNA提取及反转录按照试剂盒说明书进行。

1.3.2RT-PCR引物设计、PCR程序、测序及序列比对 TSWV核衣壳蛋白基因全长序列克隆引物参照唐前君等（2010）合成：上游5′_ATGTCTAAGGTTAAGCTCACTAAG_3′，下游5′_TYAAGCAAGTTCTGYGAGTTTTGCC_3′。TSWV小片段 RNA 3′端序列克隆引物参照尹跃艳等（2013）合成：上游5′_ TCACTGTAATGTTCCAT AGCAA_3′，下游5′_ AGAGCAATYGTGTCAATTT TATTC_3′。PCR反应体系：PrimeSTARmax Premix（2×）25 μL，上下游引物各1 μL，CDNA模版1 μL，加灭菌ddH2O至50 μL。PCR反应条件：98℃预变性2min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火5 s，72℃延伸1min，40个循环；最后72 ℃延伸5min。跑胶回收，连接克隆载体，筛选阳性菌落并摇菌，交于深圳华大基因科技服务有限公司进行测序，最后使用MEGA 6.0构建TSWV核衣壳蛋白基因系统进化树。

1.3.3TSWV人工接种、大田蓟马传毒及抗性评价

光照培养箱育苗前需充分灭菌，以保证培育的番茄苗健康，不携带任何病害。光照培养箱育苗，待幼苗长出10片真叶后，分两批处理，一批栽至大棚填有无土基质的水泥种植槽中，每个种植槽宽50Cm、长6m，作为一个小区，每个小区种植20株番茄，株距50Cm，行距40Cm，随机区组排列，3次重复，自然条件下，利用大棚内带毒蓟马接种感病；另一批参照唐前君等（2010）的接种方法给番茄叶片接种TSWV，每个番茄自交系选取10株，3次重复，以接种磷酸缓冲液为对照（CK）。

因目前没有公开的TSWV病情指数调查标准，而TSWV发病叶片上有典型的黑色坏死斑点，因此本试验参考都业娟（2013）番茄坏死条斑病的病情指数调查方法，并加以修改。分别于光照培养箱人工接种20d后和大田移栽30d后根据病情分级标准（表1）调查发病率和病情指数。

发病率（%）=（发病株数/处理总株数）×100

病情指数=〔Σ（各级病株数×各级代表数）/（调查总株数×最高级数）〕×100

表1　番茄斑萎病毒病分级标准

1.3.4数据处理 运用ExCel软件计算数据的平均值及标准偏差，并作出柱形图；利用SPSS 10.0软件中独立样本T检验比较各处理值与对照值差异的显著性。

2　结果与分析

2.1大棚自然感病条件下番茄对TSWV的抗性鉴定

经过连续3 a大棚自然感病鉴定，自交系YNAU335对TSWV表现为免疫，其他品种（系）全部感病甚至绝收（图1）。选取5号、YNAU335和CLN2037E自交系统计发病率和病情指数：YNAU335的TSWV发病率和病情指数都为0；5号和CLN2037E自交系发病率均为100%，病情指数分别为53.3和46.3。

图1　田间番茄对TSWV的抗性鉴定

2.2人工接种TSWV的番茄抗性鉴定

人工接种TSWV后，除了自交系YNAU335，其他品种（系）都表现感染TSWV的典型症状，而且植株生长被严重抑制（图2）。自交系YNAU335的TSWV发病率和病情指数均为0，表现为免疫；而5号和CLN2037E自交系的发病率分别为65%、60%，病情指数分别为36.7、29.2，表现为感病。

2.3RT-PCR鉴定番茄对TSWV的抗性及TSWV株系的确定

分别选取大田和人工接种的5号、C LN2037E和YNAU335自交系的叶片，RT_PCR克隆TSWV核衣壳蛋白基因和小片段RNA 3′端序列，结果在5号与CLN2037E叶片中均克隆出这2个核酸片段，而在YNAU335中却未克隆出（图3）。进一步测序发现，5号和CLN2037E自交系中核衣壳蛋白基因和小片段RNA 3′端序列完全相同，大小分别为781 bp和865 bp。选取核衣壳蛋白序列构建系统进化树（图4），发现TSWV分离物YNAU2015与来自昆明（AEK28762）（尹跃艳等，2013）和意大利（ADB96076）的分离物的核衣壳蛋白序列完全相同，而与另一个来自昆明的TSWV分离物（HM594685）核衣壳蛋白（唐前君等，2010）的同源率为98.84%，有3个氨基酸残基突变。

图2　番茄TSWV的人工接种抗性鉴定

图3　番茄叶片TSWV核衣壳蛋白基因和小片段RNA 3′ 端序列凝胶电泳结果

图4　TSWV核衣壳蛋白序列的系统进化树

3　结论与讨论

番茄品种拉比作为YNAU335的亲本，引自以色列，由先正达公司选育，于2006～2009年在云南番茄主产区元谋县国家科技综合示范园试种推广，拉比除了具有稳产、优质等优良性状外，其他病毒病发病率为0（赵俊等，2011）。本课题组以拉比为亲本，经过连续7代自交，选育出纯合自交系YNAU335。课题组2012年偶然发现YNAU335可能对TSWV 有抗性，2013～2015年连续3 a对YNAU335进行系统的抗性鉴别，以确定其对TSWV的抗性。

目前TSWV抗病资源主要集中在秘鲁番茄和智利番茄等野生番茄中，抗性遗传规律分别由显性质量基因Sw-5和Sw-7控制，而且2个基因并不连锁，打破Sw-5抗性的TSWV突变生理小种并不能打破Sw-7基因（Boiteux &giordano，1993；Canady et al.，2001；Hoffmann et al.，2001）。本课题组使用与Sw-5连锁的共显性SCAR标记（Dianese et al.，2010），对自交系YNAU335进行分析，结果并未克隆出任何条带（文章未列出），说明YNAU335对TSWV的抗性并不是由Sw-5基因控制。由于目前没有发掘出与Sw-7基因连锁的分子标记，课题组还不能确定YNAU335对TSWV的抗性是否是由Sw-7控制，后期还需继续研究YNAU335的抗性遗传机理。

随着Sw-5基因的发现，国外选育了一系列抗TSWV番茄品种（Stevens et al.，1991；Spassova et al.，2001）。TSWV生理小种存在地理差异性，而抗病品种中的抗病基因具有小种特性抗性，国外选育的抗病品种并不一定适合中国。最近几年，TSWV对国内番茄的危害日益严重，因此，选育适合我国的抗病品种显得尤为重要。YNAU335对TSWV表现为免疫，而且农艺性状良好，植株生长健壮，为无限生长型，果实红色，最大单果质量可达335g，可用于今后番茄抗TSWV育种中。

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Resistance Identifi cation of Tomato Inbred Line ‘YNAU335’ to TSWV

MO Yun_rong1，ZHANG Pei_xin1，DENGming_hua1，YANG Zheng_an1，ZHU Hai_shan1，ZHANG Hong1，TANG Xiao_qian1，WEN Ling2，MA Zhong_fei3，ZHAO Kai1*
（1College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Yunnan，China；2Dong_ chuandistrict Cash Crops Technology Extension Station，Dongchuan 654100，Yunnan，China；3Horticultural Technology Extension Station of Zhaoyangdistrict，Zhaotong 657000， Yunnan，China）

ReCently，Tomato spotted wilt virus（TSWV）has beCome a seriousdisease hazarding tomato produCtion. IdentifiCation and seleCtive breeding ofdisease_resistant varieties is an effeCtive approaCh to Control TSWV. This experiment seleCted tomato varieties（lines）bred by ourgroup and introduCed from other Countries，through virus transmission by thrips ingreenhouse，and artifiCial inoCulation in illumination inCubator for 3 ConseCutive years to identify thedisease resistanCe against TSWV. The results indiCated that inbred line ‘YNAU335’ was immune to TSWV，while the other varieties were all susCeptible to TSWV. Furthermore，the nuClear proteingene and small RNA 3′flank sequenCes of TSWV in leaves of ‘YNAU335’ were not Cloned. On the Contrary，these 2 sequenCes were Cloned in other tomato leaves. The results preliminarilydemonstrated that ‘YNAU335’ was resistant to TSWV，and Could be used asdisease resistant tomato resourCe in resistant breeding against TSWV .

Tomato；Tomato spotted wilt virus；Disease resistant breeding；NuCleoCapsid proteingene；ResistanCe identifiCation

莫云容，女，硕士研究生，专业方向：蔬持逆境抗性育种，E_mail：moyunrong0408@aliyun.Com

（Corresponding author）：赵凯，博士，讲师，专业方向：蔬持逆境抗性育种，E_mail： kailixian1023@aliyun.Com

2015_12_09；接受日期：2016_03_04

国家自然科学基金项目（31460525，31260481），云南省 科技计划面上项目（2015F B144），云南省教育厅项目（2015Y187）