一株石韦内生真菌S-34的鉴定及其代谢物检测与分析

李　姝，李宁浙，陈　冲，齐盼盼，宋丽菊，吴道艳，刘明栋，汪学阁，赵　建

（四川大学生命科学学院资源微生物及生物技术重点实验室，四川 成都 610064）

一株石韦内生真菌S-34的鉴定及其代谢物检测与分析

李姝，李宁浙，陈冲，齐盼盼，宋丽菊，吴道艳，刘明栋，汪学阁，赵建

（四川大学生命科学学院资源微生物及生物技术重点实验室，四川 成都 610064）

以药用植物有柄石韦叶为材料，采用组织块法与微量稀释法分离并筛选出一株具有抑菌活性的内生真菌S-34。经形态学观察、ITS测序与序列比对鉴定内生真菌S-34为链格孢属（Alternaria sp.）。进一步利用GC-MS对其代谢物进行检测与分析，结果显示：内生真菌S-34发酵液乙酸乙酯提取物的抑菌成分主要为氟苯甲酸（20.86%）、苯乙醇（4.89%）、2，3-丁二醇（3.64%），菌体乙酸乙酯提取物的抑菌成分主要为苯甲醛（2.27%）、亚麻醇（2.53%）、亚油酸单甘油酯（1.69%）、亚麻酰氯（9.28%）、反式角鲨烯（7.26%）、麦角甾醇（2.78%）。研究表明，有柄石韦内生真菌S-34的代谢物中蕴藏着较为丰富的抑菌活性物质，是开发天然药物的潜在资源。

有柄石韦；内生真菌；抑菌活性；代谢物；GC-MS

0　引　言

植物内生真菌是指普遍存在于健康植物组织的内部，但一般不引起植物病害的真菌，其与宿主协同进化形成稳定的生态关系，可产生与宿主植物相同或不同的生物活性物质［1］，在抗肿瘤、抗氧化、抗菌、杀虫等方面有一定的应用前景。钱一鑫等［2］研究发现白苞蒿内生真菌链格孢属GYBH47的粗提物具有较好的抗肿瘤活性。Tao等［3］从植物taxus chinensis var.mairei内生真菌Phomopsis sp.A240的代谢物中分离出一种具有抗氧化活性的内酯类物质。于淼等［4］对红豆杉内生真菌Xylariales sp.的代谢物进行分离纯化，并从乙酸乙酯相中分离出2种具有抑菌活性的化合物。由此可见，植物内生真菌的代谢物十分丰富。因此，从植物中分离内生真菌是获得新天然产物与新药开发的潜在资源，同时也为替代有限的药用植物资源提供了新的思路和方法。

中药石韦为水龙骨科（Polypodiaceae）石韦属（Pyrrosia）多种植物，其主要的植物来源包括有柄石韦（P.petiolosa）、庐山石韦（Pyrrosia sheareri）、毡毛石韦（Pyrrosia drakeana）等［5］。作为我国常用的中药，石韦具有利水通淋、清肺泄热、凉血止血等功效，石韦提取物同样具有抗炎利尿、抑菌、抗病毒、增强免疫力等作用［6］。目前，对于石韦主要化学活性成分研究较多，但对于石韦内生真菌代谢物的研究还未见报道。本文从有柄石韦中分离并筛选出具有抑菌活性的内生真菌S-34，并通过GC-MS对其代谢物的有效成分进行初步研究，以期为进一步利用石韦内生真菌代谢物获得新的天然产物及开发新药提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物

有柄石韦叶采自四川省阿坝藏族羌族自治州汶川县，经鉴定后于4℃保存备用。

1.1.2供试病原菌

供试病原细菌6种，其中革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococus aureus），耐久肠球菌（Enterococcus durans），藤黄微球菌（Micrococcus luteus）；革兰氏阴性菌为大肠杆菌（Escherichia coli），肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis），志贺氏杆菌（Shigella sonnei）。所有菌株均为本实验室保藏菌种。

1.1.3试剂与仪器

无水乙醇、次氯酸钠、乙酸乙酯、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、葡萄糖、琼脂粉均为国产分析纯；氯霉素（Amersco公司）；真菌基因组DNA提取试剂盒（OMEGA公司）；Premix TaqTM（TaKaRa公司）；ITS1、ITS4引物（上海英潍捷基贸易有限公司）。

恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；恒温振荡器（上海一恒科技有限公司，THZ-98C）；显微镜（OLYMPUS，DP73）；PCR仪（Analytik Jena，Easy Cycler 96）；旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司，R-201）；气相色谱质谱仪（SHIMADZU，QP2010 Plus）。

1.2方法

1.2.1培养基的配制

真菌PDA培养基与细菌LB培养基的配制参照文献［7］。

1.2.2内生真菌的分离纯化

取新鲜有柄石韦叶用自来水冲洗2h，经无菌水漂洗3遍后，用无菌滤纸吸干表面的水分。按无菌操作依次进行表面消毒：75%乙醇浸泡1 min，5.2%次氯酸钠浸泡5min，75%乙醇浸泡0.5min，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。将处理后叶片剪成0.6cm×0.6cm的小块贴于含氯霉素（34μg/mL）的PDA培养基表面，每个平板放置4片，于28℃条件下培养3～15d，以最后一次消毒所用无菌水涂布平板作为对照。待叶片周围长出菌丝后，挑取菌丝顶端部分转入PDA培养基（含氯霉素）中逐步纯化，即得有柄石韦内生真菌，并于4℃保存备用。

1.2.3内生真菌S-34的形态观察

将内生真菌S-34点接于PDA培养基上培养，分别观察菌落形态及菌丝体显微形态。

1.2.4内生真菌S-34的分子鉴定

按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取S-34的基因组DNA，以ITS1：5＇-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3＇、ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇为通用引物［8］分别扩增内生真菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列。PCR反应体系为DNA模板4μL、上下游引物各2μL、Premix Taq 25μL、ddH2O 17μL。PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，循环30次；72℃延伸5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并送由上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。测序结果拼接后通过NCBI的BLAST平台进行序列同源性分析，选取相似度高的序列进行Clustal W多重序列比对，采用软件MEGA 6通过N-J法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，自展值（Bootstrap）为1000。

1.2.5内生真菌S-34提取物的制备

取2块直径约6 mm的内生真菌S-34菌饼接种于装有150 mL PDA培养基的300 mL摇瓶中，120r/min，28℃摇床培养8d。培养物以4层纱布过滤，得内生真菌发酵液和菌丝体。发酵液与乙酸乙酯等体积混合24 h后萃取3次，合并萃取液，乙酸乙酯相40℃减压旋蒸浓缩至2mL，得发酵液乙酸乙酯提取物A；菌丝体经液氮充分研磨后用乙酸乙酯浸泡24 h，乙酸乙酯相40℃减压旋蒸浓缩至2 mL，得菌丝体乙酸乙酯提取物B；酯提液分别经微孔膜（0.22μm）过滤除菌后于4℃保存备用。

1.2.6内生真菌S-34提取物抑菌活性的测定

采用微量稀释法测定提取物的抑菌活性。先将已活化的各供试病原细菌转接入LB液体培养基中，37℃培养过夜，用LB液体培养基稀释至108CFU/mL。向96孔板中分别加入0，25，50，100 μL的提取物，用LB液体培养基补齐各孔至190μL，混匀后取10μL菌悬液加入各孔，37℃培养12h。将各孔培养物适当稀释，取100 μL涂布平板，37℃培养24 h后进行菌落计数，重复3次。以乙酸乙酯作为提取物的阴性对照，以不加任何提取物作为空白对照。抑制率计算方法如下：

抑制率=（阴性对照菌落数-实验组菌落数）/

空白对照菌落数×100%

1.2.7内生真菌S-34提取物的GC-MS检测

采用GC-MS分别对内生真菌S-34提取物A与提取物B进行检测，并初步分析其主要成分。GC-MS条件：载气为氦气，柱流量1.0 mL/min，进样温度290℃，进样压力49.5kPa，进样体积1μL，分流比：10∶1。柱箱程序：初始温度40℃，保持5min；以10℃/min升至100℃，保持5 min；以5℃/min升至200℃，保持5min；以10℃/min升至280℃，保持5min；以5℃/min升至300℃，保持5 min。离子源与接口温度分别为200℃，220℃。电子能量70eV。全扫描范围22～600m/z。溶剂延迟时间3.5min。

检测时以PDA培养基乙酸乙酯提取物作为空白对照。

2　结果与分析

2.1内生真菌S-34的形态特征

有柄石韦叶经表面消毒，最后一次清洗所用无菌水涂布平板无杂菌长出，表明消毒彻底，分离到的真菌为有柄石韦的内生真菌。内生真菌S-34在PDA培养基上初期菌落为白色，后期逐渐变为灰褐色，绒毛状，菌落边缘较整齐，背面呈深墨绿色（见图1（a））。S-34菌丝细长，有横膈，末端有分支（见图1（b），图1（c））。

图1　S-34菌落形态与显微形态

2.2内生真菌S-34的ITS序列测定及系统进化树构建

内生真菌S-34的ITS序列大小为566 bp。经BLAST比对显示，S-34与链格孢属（Alternaria sp.）具有较高同源性，其中与Alternaria brassicae W3（JF439450.1）相似性达99%。筛选与S-34同源性较高的序列通过N-J法构建系统进化树（见图2），结果显示S-34与Alternaria brassicae W3处于同一分支，1000次自展分析完全支持该分支。

2.3内生真菌S-34提取物的抑菌活性测定

内生真菌S-34提取物对不同病原菌的抑制结果见表1、表2。提取物A与提取物B对6种供试病原细菌均有较好的抑菌效果，并随提取物加入量的增加，抑菌效果增强。在提取物加入量为25 μL时，提取物A对藤黄微球菌的抑菌效果最好，抑菌率达71.02%，提取物B对志贺氏杆菌的抑菌效果最好，抑菌率达73.76%。对于革兰氏阴性菌而言，提取物B的抑菌效果普遍强于提取物A，对于革兰氏阳性菌而言，提取物A的抑菌效果普遍强于提取物B。

2.4内生真菌S-34提取物的GC-MS检测与分析

根据GC-MS的分析结果，对比去除空白对照后，内生真菌S-34提取物A与提取物B分别检测出26种、34种化合物，主要成分见表3、表4，各类物质所含化合物的数量与相对含量见图3。由图可知，提取物A主要包含5类物质，其中以烃类、醇类所含化合物种类最为丰富，分别检测到8种烃类物质、6种醇类物质，以酸类、烃类、醇类的含量较高，分别占提取物A的21.24%、17.24%、13.34%。提取物B主要包含8类物质，其中以烃类、酯类所含化合物种类最为丰富，分别检测到8种烃类物质、7种酯类物质，以酯类、烃类、脂类的含量较高，分别占提取物B的18.10%、16.91%、12.56%。

图2　内生真菌S-34的系统进化树

表1　内生真菌S-34提取物对病原菌的抑菌作用　CFU/mL

表2　内生真菌S-34提取物对病原菌的抑制率

表3　内生真菌S-34提取物A化学成分检测结果

3　结束语

本文对新鲜有柄石韦的内生真菌进行分离纯化，筛选出一株具有抑菌活性的内生真菌S-34，经形态学与分子学的方法，并结合ITS序列比对与系统进化树的构建，鉴定其为链格孢属（Alternaria sp.）。Ge［9］、田仁鹏［10］等分别从北方、南方红豆杉中分离出产抗肿瘤活性物质紫杉醇的内生真菌链格孢属。刘艳等［11］从海南粗榧中分离出产抗癌活性物质高三尖杉酯碱的内生真菌细极链格孢。蔡庆秀等［12］从药用植物辣木中分离出一株内生真菌链格孢属，其发酵液乙酸乙酯提取物的主要抑菌成分为链格苝醇。张弘驰等［13］从无花果内生真菌链格孢属FL24的发酵液粗提物中分离出具有抗菌活性的麦角甾醇，与本研究的结果有相似之处。这表明链格孢属作为植物的内生真菌，其代谢物中的活性成分十分丰富。

表4　内生真菌S-34提取物B化学成分检测结果

图3　内生真菌S-34提取物种类数量与相对含量

内生真菌S-34发酵上清液与菌体经乙酸乙酯提取后，对6种常见的供试病原细菌均具有明显的抑制作用。利用GC-MS对两种酯提物进行分析，结果表明其发酵上清液乙酸乙酯提取物的成分主要为酸类、烃类、醇类，这几种物质所含化合物种类也相对较多，而菌体乙酸乙酯提取物的成分主要为酯类、烃类、脂类。两种酯提物所含成分的不同可能导致其对不同病原菌的作用效果不同。

目前已有研究报道，有机酸类、醇类、脂类（甾醇等）具有抑菌效应。李舜等［14］利用苯甲酸与中药抽提液进行复配，发现其抑菌效果显著且优于单纯中药提取液。沈生强等［15］以氟苯甲酸为原料合成的化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌均具有较好的抑菌效果。梁海燕等［16］研究证明了苯乙醇的抗真菌能力。李玉珍等［17］从小麦中分离的抗毒素有效成分2，3-丁二醇对小麦赤霉具有较好的抑菌效力。本实验所研究的内生真菌S-34发酵上清液乙酸乙酯提取物中也含有抑菌物质氟苯甲酸（20.86%）、苯乙醇（4.89%）与2，3-丁二醇（3.64%）。此外，内生真菌S-34菌体乙酸乙酯提取物中也检测出6种具有抑菌活性的物质，分别是苯甲醛、亚麻醇、亚油酸单甘油酯、亚麻酰氯、反式角鲨烯、麦角甾醇［18-19］，其抑菌成分的总相对含量较高，达26.35%。这表明有柄石韦内生真菌S-34提取物中存在丰富的抑菌活性成分，可望与药用植物研究相结合以推动药用植物的可持续性开发利用。

［1］ABRAHÃO MRE，MOLINAG，PASTORE GM. Endophytes：Recent developments in biotechnology and the potential for flavor production［J］.Food Research International，2013，52（1）：367-372.

［2］钱一鑫，康冀川，雷帮星，等.贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌的筛选与鉴定［J］.中国中药杂志，2014，39（3）：438-441.

［3］TAO M H，CHEN Y C，WEI X Y，et al.Chemical constituentsoftheendophyticfungusPhomopsissp. A240 isolated from Taxus chinensis var.mairei［J］.Helvetica Chimica Acta，2014，97（3）：426-430.

［4］于淼，林筱，张连茹.一株红豆杉内生真菌Xylariales sp.次级代谢产物的研究［J］.时珍国医国药，2016，27（2）：319-321.

［5］陈露，刘布鸣，马军花，等.中药石韦的研究概况［J］.广西医学，2011，33（11）：1486-1489.

［6］陈丽君，马永杰，李玉鹏，等.石韦属植物化学和药理研究进展［J］.安徽农业科学，2011，39（10）：5786-5787.

［7］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，2007：77-102.

［8］杨迎迎，熊智强，王勇.3种药用植物内生真菌的多样性分析及产生物碱菌株的筛选［J］.中国抗生素杂志，2013，38（12）：901-908.

［9］GE J P，PING W X，ZHOU D P.Characterization of a new species of taxol-producing fungus［J］.Nature and Science，2004，2（1）：85-88.

［10］田仁鹏，杨桥，周国玲，等.一株产紫杉醇的南方红豆杉内生真菌的分离及分类研究［J］.植物科学学报，2006，24（6）：541-545.

［11］刘艳.海南粗榧内生真菌CH1307鉴定及其抗肿瘤活性研究［D］.海口：海南大学，2012.

［12］蔡庆秀，赵金浩，王佳莹，等.辣木内生真菌LM033的分离鉴定及其代谢产物抗植物病原菌活性［J］.中国新药杂志，2013（18）：2168-2173.

［13］张弘弛.无花果内生真菌次生代谢产物及抑菌活性的研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2007.

［14］李舜，李筱青，徐守云，等.苯甲酸复配中药抽提液的抑菌效果及刺激性［J］.上海医药，2014（9）：017.

［15］沈生强，孙晓红，刘源发，等.5-（4-氟苯基）-1，3，4-噁二唑-2-巯基乙酰腙类化合物的合成表征及生物活性［J］.化学通报，2014，77（3）：265-269.

［16］梁海燕，王国昌，秦雪峰，等.6种芳香族挥发性有机物对黄曲霉的抑菌作用［J］.环境与健康杂志，2013（2）：017.

［17］李玉珍，余露.小麦赤霉菌抗毒素有效成分的鉴定［J］.分析化学，1994，22（1）：87-89.

［18］王奎，冯颖，何钊，等.美洲大蠊中两个有抑菌活性的单甘酯的研究［J］.时珍国医国药，2013，24（9）：2102-2103.

［19］JOEL E L，BHIMBA V.Isolation and characterization of secondary metabolites from the mangrove plant Rhizophoramucronata［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2010，3（8）：602-604.

（编辑：莫婕）

Identification of an endophytic fungus S-34 isolated from Pyrrosia petiolosa and analysis of its metabolites

LI Shu，LI Ningzhe，CHEN Chong，QI Panpan，SONG Liju，WU Daoyan，LIU Mingdong，WANG Xuege，ZHAO Jian
（Key Laboratory of Microbiological Resource and Technology，College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

An endophytic fungus S-34 which has antimicrobial activity was isolated from the leaves of the Chinese medicinal plant P.petiolosa through a tissue separating method and a microdilution method.The endophytic fungus S-34 was identified as Alternaria sp.according to the morphologic observation and ITS sequence analysis.Its metabolites were further studied with GC-MS.The findings show that the main antibacterial components of the fermentation liquid of S-34 extracted with ethyl acetate were fluorobenzoic acid（20.86%），phenylethyl alcohol（4.89%），2，3-butanediol（3.64%）.Besides，the main antibacterial components of the mycelia ethyl acetate extract were benzaldehyde（2.27%），linoleny alcohol（2.53%），9，12-octadecadienoicacid（Z，Z）-2，3-dihydroxypropyl ester（1.69%），9，12-octadecadienoylchloride，（Z，Z）-（9.28%），2，6，10，14，18，22-tetracosahexaene，2，6，10，15，19，23-hexamethyl-，（all-E）-（7.26%），neoergosterol（2.78%）.As indicated in the study above，the endophytic fungus S-34 of P.petiolosa contains plenty of antibacterial substances as potential resources for the development of natural medicines.

P.petiolosa；endophytic fungi；antimicrobial activities；metabolite；GC-MS

A

1674-5124（2016）05-0061-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.013

2016-01-15；

2016-02-13

国家自然科学基金（31270175）；教育部新世纪人才和川大优秀青年学者项目（NCET-13-0397，2013SCU04B14）

李姝（1991-），女，湖北宜昌市人，硕士研究生，专业方向为资源微生物应用。

赵建（1976-），男，江苏扬州市人，教授，博士，主要从事资源微生物及微生物天然免疫研究。