复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠血管重塑单核细胞趋化蛋白-1和基质金属蛋白酶-9表达的影响

冯进，张稳，卿俊，刘惠敏，谭元生，4

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410208

·实验研究·

复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠血管重塑单核细胞趋化蛋白-1和基质金属蛋白酶-9表达的影响

冯进1，张稳1，卿俊2，刘惠敏3，谭元生3，4

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410208

目的观察复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠（SHR）血管重塑单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法24只12周龄雄性SHR随机分为模型组、复方钩藤降压片组和阳性药组，每组8只，另设8只WKY大鼠为空白对照组。各给药组给予相应药物灌胃，连续6周。无创尾动脉测压法观测血压；HE染色观察大鼠胸主动脉、肾动脉形态学变化；免疫组化检测胸主动脉内皮细胞MCP-1、MMP-9的蛋白表达。结果模型组胸主动脉壁MCP-1、MMP-9蛋白表达明显高于空白对照组（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组胸主动脉壁 MCP-1、MMP-9蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；复方钩藤降压片组与阳性药组比较，胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达无明显差异。结论复方钩藤降压片具有降低SHR血压，减轻炎症反应，调控血管重塑的作用，其机制可能与下调SHR胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达有关。

复方钩藤降压片；自发性高血压大鼠；血管重塑；单核细胞趋化蛋白-1；基质金属蛋白酶-9

高血压病是一种由多种病因相互作用导致的、复杂的、进行性的心血管综合征。近年来，炎症因素在高血压病的发生、发展及转归中的作用受到关注。有研究认为，高血压病是一个慢性炎症过程，可以产生炎症因子，影响血压水平，损伤血管内皮功能，加速血管重塑。前期研究表明，复方钩藤降压片具有降低血压，逆转心脏、肾脏的超微结构，减少血管的损伤，减轻高血压炎症反应等作用［1-5］。本实验通过观察复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠（SHR）血管重塑相关炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1　实验材料

1.1动物

SHR 24只、WKY大鼠8只，清洁级，雄性，体质量180～220 g，鼠龄12周，北京维通利华实验技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。分8笼饲养，每笼4只，室温22 ℃～25 ℃、湿度50%～60%，人工光照时间明暗各半、环境安静。喂饲相同标准饲料（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）、实验用三级用水（湖南中医药大学东塘校区综合楼实验室）。

1.2药物

复方钩藤降压片，湖南中医药大学第一附属医院药剂制剂中心，0.4 g/片，批号131209；厄贝沙坦片，法国赛诺菲制药公司，150 mg/片，批号4A449。

1.3主要试剂与仪器

血清MCP-1、MMP-9免疫组化试剂盒，长沙丽欣生物技术有限公司；BP98A无创血压检测仪，北京软隆科技有限责任公司；TDZ4 WS低速台式离心机，长沙湘仪仪器厂；LEICA DM LB2型双目显微镜，德国LEICA公司；Motic B5显微摄像系统，麦克奥迪实业集团公司；MIAS医学图象分析系统，北航公司；Shandon325型石蜡切片机，英国Shandon公司。

2　实验方法

2.1分组与给药

先将SHR按血压分层，随机将24只SHR分为模型组、复方钩藤降压片组、阳性药组，每组8只。以8只WKY大鼠为空白对照组。按成人体质量70 kg折算，按成人临床用药剂量折合大鼠等效剂量。复方钩藤降压片组：用蒸馏水将复方钩藤降压片配成混悬液，予439.77 mg/（kg·d）灌胃；阳性药组：用蒸馏水将厄贝沙坦片配成混悬液，予13.74 mg/（kg·d）灌胃；模型组和空白对照组给予等量蒸馏水灌胃。每日9∶00按10 mL/kg给药，连续6周。

2.2标本采集

第6周测完血压后，大鼠10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，打开胸腔、腹腔，取血后分离胸主动脉、肾动脉，置于10%甲醛固定24 h。

2.3观察指标

2.3.1大鼠尾动脉收缩压测量各组于灌胃后 2 h开始专人测量血压，每周1次，保持环境安静、恒温（25 ℃）、清醒非激怒状态下测量大鼠尾动脉收缩压，将大鼠固定装置和测量主机电预热30 min，大鼠置于固定网套中通过尾套固定，预热10 min，使尾部动脉扩张，再将压脉套套至大鼠尾部近心端，1/3在大鼠尾，打开脉冲波形记录系统，充气使压力上升到动脉搏动消失，然后慢慢放气，读取血压值，此即尾动脉收缩压，重复测量3次，取平均值。

2.3.2胸主动脉、肾动脉组织形态学观察用75%～100%乙醇梯度脱水；浸蜡、包埋、切片（4 μm），60 ℃烤片机烘烤12 h，置于4 ℃冰箱中备用。切片脱蜡至水、HE染色、二甲苯透明中性树胶封片，待玻片干后，从低倍镜至高倍镜各拍取1张，光学显微镜下观察组织病理变化。

2.3.3胸主动脉壁内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-9蛋白表达测定按免疫试剂盒说明方法进行操作。先将组织切片在二甲苯中脱蜡，持续10～15 min，然后放在100%、95%、80%梯度乙醇脱水，脱水时间为每个浓度10 min，然后用蒸馏水洗涤2次×5 min。再封闭内源性过氧化物酶、微波炉加热修复抗原、正常羊血清封闭液滴添加到每张切片进行非特异性抗原封闭、滴加第一抗体、滴加生物素化抗小鼠IgG、DAB显色、蒸馏水终止显色、脱水、透明等处理，采集图像。应用MOTIC图像分析软件对所取图片定量分析，阳性信号为胞质或胞核呈现棕黄色颗粒，测定阳性颗粒的平均光密度（AOD）值。AOD值越大阳性越强，AOD值越小阳性越弱。

3　统计学方法

4　结果

4.1复方钩藤降压片对模型大鼠尾动脉收缩压的影响

与空白对照组比较，模型组SHR尾动脉收缩压明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，除第0周外，各给药组SHR尾动脉收缩压明显降低（P＜0.05，P＜0.01），但阳性药组较复方钩藤降压片组降低明显（P＜0.05）。结果见表1。

表1　各组大鼠尾动脉收缩压比较（±s，mm Hg）

表1　各组大鼠尾动脉收缩压比较（±s，mm Hg）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与复方钩藤降压片组比较，※P＜0.05

组别　只数 第0周　第1周　第2周　第3周　第4周　第5周　第6周空白对照组　8　126.62±10.5　134.29± 8.2　135.30± 7.2　137.83± 7.5　132.07± 7.6　131.17± 7.8　132.96± 6.9模型组　8　177.70± 9.8**　181.19±16.1**　180.24±15.2**　179.38±11.4**　182.68±14.3**　183.33±13.7**　189.14±12.3**阳性药组　8　178.88±11.9　139.67±13.9##※138.47±14.5##※128.75± 4.3##※126.40±11.1##※　125.50±11.3##※112.58±12.1##※复方钩藤降压片组　8　176.62±18.9　156.76±10.7#　155.55±10.6#　159.29± 8.6#　157.46±14.3#　157.24±14.7#　154.57± 9.9#

4.2复方钩藤降压片对模型大鼠胸主动脉病理形态的影响

空白对照组胸主动脉内膜与内膜上皮完整，中膜平滑肌细胞核、弹性纤维完整，外膜与中膜分界明显；模型组胸主动脉内膜与内膜上皮局部有斑块，内膜上有少量炎症细胞附着，内皮细胞不完整，中膜外层平滑肌细胞核、弹性纤维排列不整齐，外膜与中膜分界欠佳；阳性药组胸主动脉内膜与内膜上皮基本完整，内膜上有单个炎症细胞附着，中膜平滑肌细胞核、弹性纤维排列整齐，外膜与中膜分界欠佳，外膜正常；复方钩藤降压片组胸主动脉内膜与内膜上皮完整，中膜平滑肌细胞核、弹性纤维排列整齐，外膜与中膜分界清楚。结果见图1。

图1　各组大鼠胸主动脉病理形态（HE染色，×400）

4.3复方钩藤降压片对模型大鼠肾动脉病理形态的影响

空白对照组肾动脉内膜与内膜上皮完整，中膜平滑肌细胞核、纤维完整，外膜正常；模型组肾动脉内膜与内膜上皮大多数完整，局部有缺损，中膜平滑肌细胞核、纤维排列紊乱，外膜正常；阳性药组肾动脉内膜与内膜上皮完整，中膜平滑肌细胞核、纤维基本正常，外膜正常；复方钩藤降压片组肾动脉内膜与内膜上皮完整，中膜平滑肌细胞核、纤维排列正常，外膜正常。结果见图2。

图2　各组大鼠肾动脉病理形态（HE染色，×400）

4.4复方钩藤降压片对模型大鼠胸主动脉壁单核细胞趋化蛋白-1、基质金属蛋白酶-9蛋白表达的影响

空白对照组胸主动脉壁内膜与内膜上皮弱阳性，中膜小部分平滑肌细胞核弱阳性，外膜纤维部分弱阳性；模型组胸主动脉壁内膜与内膜上皮阳性，中膜部分平滑肌细胞核阳性，外膜纤维阳性；阳性药组胸主动脉壁内膜与内膜上皮轻度阳性，中膜少量平滑肌细胞核弱阳性，外膜纤维部分弱阳性；复方钩藤降压片组胸主动脉壁内膜与内膜上皮轻度阳性，中膜少量平滑肌细胞核弱阳性，外膜纤维部分弱阳性。阳性颗粒为棕黄色，主要位于细胞核中，见图3。空白对照组胸主动脉内膜与内膜上皮强阳性，中膜少数平滑肌细胞核弱阳性，外膜纤维强阳性；模型组胸主动脉内膜与内膜上皮强阳性，中膜部分平滑肌细胞核、胞质弱阳性，外膜纤维强阳性；阳性药组胸主动脉内膜与内膜上皮强阳性，中膜少量平滑肌细胞核弱阳性，外膜纤维强阳性；复方钩藤降压片组胸主动脉内膜与内膜上皮强阳性，中膜近内膜部平滑肌细胞核弱阳性，外膜纤维强阳性。阳性颗粒为棕黄色，主要位于细胞核、细胞质中，见图4。与空白对照组比较，模型组胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

图3　各组大鼠胸主动脉壁内皮细胞MCP-1病理形态（免疫组化染色，×400）

图4　各组大鼠胸主动脉壁内皮细胞MMP-9病理形态（免疫组化染色，×400）

表2　各组大鼠胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达比较（±s，AOD值）

表2　各组大鼠胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达比较（±s，AOD值）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别　只数　MCP-1　MMP-9空白对照组　8　0.45±0.15　0.52±0.24模型组　8　0.77±0.18**　0.88±0.22**阳性药组　8　0.60±0.11#　0.61±0.04##复方钩藤降压片组　8　0.56±0.14##　0.66±0.17#

5　讨论

血管重塑是心血管疾病的靶器官损害的共同病理基础，贯穿于高血压病发生、发展的整个过程。有研究者利用自发性高血压卒中型大鼠脑模型研究血管重塑，发现动脉壁平滑肌细胞重新排列和平滑肌细胞增生，血管反应性的改变直接侵犯管腔等均可导致血管扩张、管壁肥厚、血管重塑［6］。

有研究显示，MCP-1、MMP-9等炎症因子与高血压病血管重塑密切相关［7］。MCP-1属于趋化因子，在众多SHR模型中，检测到靶器官内MCP-1表达均增强；有研究显示，MCP-1对单核/巨噬细胞及T淋巴细胞有强烈化学趋化性［8］。MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员中明胶酶的一种，是一种炎症标记物。高血压时，血压异常波动容易导致血管内皮功能受损，并伴有大量的炎性细胞因子参与炎症因子的表达，可刺激MMP-9增强［7］；研究表明，增强MMP-9的表达和活性，将影响众多心血管疾病的发生和发展，尤其与高血压相关［9-11］；Derosa等［12］发现高血压病患者心脏和血液中MMP-9、MMP-2表达均上调；Tayebjee等［13］研究发现，高血压病患者血浆MMP-9水平在治疗前显著升高，标准治疗后均下降，且血浆 MMP-9浓度与心血管危险呈正相关趋势。

高血压病属中医学“眩晕”范畴，多为本虚标实之证，肝肾亏虚为其本，风、瘀为其标。复方钩藤降压片是基于阴虚-阳亢-络阻机制而设立，方中钩藤清热平肝、熄风定惊，为君药。川芎活血化瘀、行气止痛；麦冬养阴生津、滋补肝阴，使肝阳平复，肝风自灭，与川芎共为臣药。诸药合用，共奏养阴、清热、柔肝、活血通络之效。本研究结果显示，模型组较空白对照组 MCP-1、MMP-9表达呈上升趋势，提示MCP-1、MMP-9参与高血压病血管重塑。叶氏等［14］发现复方钩藤降压片能有效地降低 SHR血压及逆转左室肥厚；能明显降低胸主动脉中膜厚度，抑制胸主动脉血管重塑；显著促进血管内皮依赖性舒张功能，抑制血管重构。本研究表明，复方钩藤降压片对SHR具有较好的降压效果，与前期实验结果一致，降压温和、平稳。该方能减轻炎症反应，调控血管重塑，保护靶器官。此作用可能是通过下调胸主动脉壁内皮细胞MCP-1、MMP-9蛋白表达而实现的。

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［14］ 叶舒婷，谭超，黄娟娟，等.复方钩藤降压片治疗高血压病左室肥厚（阴虚阳亢、瘀血阻络证）31例临床观察［J］.中医药导报，2013，19（5）：8-10.

Effects of Compound Uncaria Hypotensive Tablets on Expressions of MCP-1 and MMP-9 of Vascular Remodeling in Spontaneously Hypertensive Rats

FENG Jin1，
ZHANG Wen1， QING Jun2，LIU Hui-min3， TAN Yuan-sheng3，4
（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007， China； 2. Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China；3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 4. Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410208， China）

Objective To observe the effects of Compound Uncaria Hypotensive Tablets on expressions of MCP-1 and MMP-9 of vascular remodeling in spontaneously hypertensive rats （SHR）； To discuss it possible mechanism of action. Methods Totally 24 12-week old male SHR were randomly divided into SHR model group， Compound Uncaria Hypotensive Tablets group， and positive medicine group， with 8 rats in each group. Another 8 WKY rats were set as normal control group. Medication groups were given relevant medicine for gavage for successive 6 weeks. Noninvasive tail cuff method was used to observe blood pressure； morphological changes in thoracic aorta and renal artery were observed by HE staining； immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall. Results Protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall of SHR model group were significantly higher than those of normal control group （P＜0.01）； Compared with the SHR model group， protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall decreased significantly in the medication groups （P＜0.05， P＜0.01）； Compared the Compound Uncaria Hypotensive Tablets group and positive medicinegroup， there was no obvious difference in protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall. Conclusion Compound Uncaria Hypotensive Tablets can reduce the blood pressure of SHR， reduce inflammation reaction， and regulate vascular remodeling， which mechanism may be related to down-regulation of expressions of MCP-1 and MMP-9 in SHR aortic endothelial cells.

Compound Uncaria Hypotensive Tablets； spontaneously hypertensive rats； vascular remodeling；MCP-1； MMP-9

R285.5

A

1005-5304（2016）10-0051-05

2016-01-10）

（

2016-02-26；编辑：华强）

国家自然科学基金（81473616）；湖南省科技厅重点项目（2013SK2025）；湖南省教育厅重点项目（15A142）；湖南省中医药管理局重点项目（201403）；湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室开放基金（ZYFT201503）

谭元生，E-mail：tys702@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.013