口蹄疫疫苗研究进展

曾刚秀，陈贵英，曾玉梅，朱庭俊

（1.重庆市荣昌区昌州畜牧兽医站，重庆 荣昌 402460；2.重庆市荣昌区峰高畜牧兽医站，重庆 荣昌 402460；3.重庆市荣昌区远觉畜牧兽医站，重庆 荣昌 402460）

口蹄疫疫苗研究进展

曾刚秀1，陈贵英1，曾玉梅2，朱庭俊3

（1.重庆市荣昌区昌州畜牧兽医站，重庆 荣昌 402460；2.重庆市荣昌区峰高畜牧兽医站，重庆 荣昌 402460；3.重庆市荣昌区远觉畜牧兽医站，重庆 荣昌 402460）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由具有抗原易变性、血清多样性的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病具有易感动物种类繁多、传播途径多样、四季均可发病等特点，死亡率很低，一般在2.5%左右，但发病率却可达到100%。病畜主要表现为口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水疱和溃烂，造成行动与饮食不便，从而导致发育迟缓，如果是犊牛或仔猪发病，其死亡率可高达65%，给养殖业带来重大经济损失。目前防控该病主要通过疫苗免疫和无害化处理方法，本文通过对口蹄疫疫苗的研究进行综述，目的是为生产实践为防控该病提供理论依据。

1　传统疫苗

1.1弱毒苗

弱毒疫苗是指经过充分制弱的，但它仍然可以在动物体内增殖，还可以引起动物接种无症状感染的发病率，使机体产生一个非常强大的和持久的抗病毒制剂。弱毒疫苗的优点是，在许多方面，如成本低，良好的免疫原性和抗体持续时间长和接种途径多样化等优点，但弱毒疫苗也有很多缺点，比如很多方法从根本上无法克服，免疫动物后，动物可能会产生病毒血症，排毒及病毒返强、长期带毒等一系列的缺点，因为该疫苗具有以上的种种不足，所以在临床上大量使用活疫苗是有限的，为了使口蹄疫病疫苗更安全可靠，为了保护动物的安全，人们就探索出了一些相对而言比较安全可靠的新型疫苗。

1.2灭活苗

灭活疫苗是使用化学或物理的方法使口蹄疫病毒失去毒力，但保留抗原性，加入佐剂制成的疫苗。灭活疫苗的灭活剂多种多样的。灭活疫苗的制备有3个重要的步骤：

（1）考虑获得大量的病毒抗原的方式。

（2）正确选择灭活疫苗的灭活方法和灭活剂。

（3）免疫佐剂的选择必须考虑佐剂的毒副作用等。汉森和施密特（1934年）发现了氢氧化铝凝胶的辅助，不仅没有发现毒性，并还具有有效增强免疫力的功效。荷兰学者弗兰克（1935年），通过在体外培养的牛、羊、猪胚胎皮肤，使用固定的组织培养方法等，在口蹄疫病病毒培养上获得成功。河谷（1925）采集了FMDV感染牛的水疱液，通过使用灭活剂甲醛灭活，第一次成功研制了口蹄疫病灭活疫苗。贝林和他的同事（1926～1929年）首次使用口蹄疫发病牛舌皮组织病料通过甲醛灭活制造口蹄疫灭活疫苗。弗兰克尔（1947年）利用牛舌上皮细胞培养方法，发展了自己创造的组织块弗兰克尔法，并用其增殖FMDV，使大规模病毒抗原生产技术获得成功，从那时起，能够一次生产大量的口蹄疫病毒疫苗。贝科（1952）首先用胰蛋白酶消化动物肾脏皮质，获得初代单层肾上皮细胞的培养成功，口蹄疫病病毒在初代单层肾上皮细胞上成功生长。然而，在1938～1962年很长一段时间内，口蹄疫病疫苗一直是由动物组织产生病毒抗原，然后用甲醛灭活，加入氢氧化铝凝胶吸附而生产出来的（王永录等2009）。自1962年理想的BHK-21细胞问世至今，它已成为制备口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想细胞系，被广泛应用于生产口蹄疫疫苗（潘丽等，2003），目前，世界上仍然主要使用口蹄疫病灭活疫苗，但人们不仅仅局限于单价灭活疫苗，而是想办法研制双价灭活疫苗，如张永光（1995）的二价牛O型—A型口蹄疫灭活疫苗的研制成功，在牛的口蹄疫病的预防上已经取得了理想的效果。然而，越来越多的测试显示，通过甲醛灭活的口蹄疫疫苗与口蹄疫的多次发生是有很大关系的，所以甲醛灭活口蹄疫疫苗受到质疑，但是如果不使用灭活苗而使用活苗，毒性大，也可能会造成巨大的损失，除了动物免疫力差，活苗里面有很多的病毒也有较强的毒性，那么整个生物就存在极大的安全隐患，使得生产难度系数加大，生产成本相应地提高，疫苗的用量也很大，由于有以上的这些问题，所以迫切需要研究和开发新的口蹄疫疫苗。

2　新疫苗

由于传统疫苗有很多的问题，科学家根据实际生产需要，开始发展口蹄疫新疫苗，发展要达到的目标是高效、安全、多价、经济。自上世纪70年代，随着分子生物学和生物工程等学科的不断发展，新的口蹄疫疫苗的免疫组化研究取得了很大的进步。

2.1口蹄疫核酸疫苗

核酸疫苗是近年来发展起来的一种新的生物技术，具有非常广阔的应用前景，具有成本低，稳定性好，免疫期长，生产工艺简单，抗原呈递过程和病原体的感染是非常相似的，核酸疫苗，通常被称为基因疫苗，又称多核苷酸疫苗，“裸”DNA核酸疫苗，DNA疫苗。事实上是外源性抗原的基因克隆到载体和质粒，然后病毒DNA或质粒直接注射到动物体内后的重组，使外源基因在体内表达，产生天然蛋白抗原，激活免疫系统，并能不断地引起免疫反应。不过短时间内，DNA疫苗如果想要取代当前已广泛使用的传统的疫苗还是不容易的。但只要加大力度研究DNA疫苗，核酸疫苗一定可以得到更好更多的新突破。

2.2口蹄疫重组活载体疫苗所谓的活载体疫苗，就是把微生物保护性的抗原基因插入到载体病毒上，载体病毒就多种多样了，有的采用的疱疹病毒、痘病毒等的特殊地方，然后使载体病毒转染细胞，在细胞中不断地复制，当然也同时来表达外源基因的产物，简单概括也就是抗原。不同的几个外源基因可以同时插入到一个载体病毒中，同时表达多种病原微生物的抗原，能够预防多种不同的传染病。近些年来，除了用病毒作载体之外，还有很多的专家是把细菌做载体的。腺病毒是在口蹄疫病毒载体疫苗的研究中最常使用的一种病毒。腺病毒是一种单分子线状双股的DNA病毒，基因组的大小大概为34～43kb，由252个壳粒组成，包括12个五邻体、12根纤毛及240个六邻体，没有囊膜，核衣壳呈20面体对称。此外，还存在着很多其他的小分子蛋白 。六邻体形成病毒衣壳20个三角形的面，12个顶端是5个五邻体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五邻体的蛋白为基础，从壳顶表面延伸，形成纤毛顶端的头节。头节区纤毛和五邻体与细胞表面受体结合，在病毒感染细胞过程中具有十分重要的作用。在腺病毒基因组两端各有100～140bp的一段末端反向重复序列（末端反向重复，ITR），ITR是病毒复制起始位点，并且，这个阶段的病毒复制是整个过程中不能缺少的。ITR3有一个长约300bp的包装信号在左方，主要作用就是介导包装腺病毒基因组的病毒衣壳结构。所谓的腺病毒，是一个顺式作用元件仅包括约0.5kb序列ITR包装信号，换句话来说，就是必须引起腺病毒载体自我携带和超过30种蛋白质可以被其他病毒辅助（或细胞）提供。近年来，许多研究者在研究口蹄疫腺病毒载体病毒疫苗，现在，大部分相关的报道都是关于E3和E1编码区的AdHu5为载体，有些载体还缺失了E4基因编码区。复制缺陷腺病毒表达口蹄疫病毒P1基因编码区的重组是通过桑斯帕拉试验来证明的，通过皮下和鼻咽这两种免疫途径来免疫牛只，后面2次仅仅能产生一小部分的免疫保护力。含有口蹄疫病毒A24/A12Mayr构建的嵌合重组腺病毒P1-2A-3C基因，根据3C计划的腺病毒可将腺病毒划分为野生型和突变株两种重组腺病毒，这个实验也证实，只有3C野生型重组腺病毒才能把聚蛋白P1裂解成为VP0、VP1和VP3，中和抗体可以在被刺激动物机体内产生很高的水平，从而进一步验证了衣壳的装配3C蛋白酶的必要性；孙普（2007）和其他专家也指出，腺病毒免疫猪体分别在第7天的重组，14d和21d的病毒攻击相同的类型，也有的很好的保护作用。

2.3口蹄疫合成肽疫苗

口蹄疫合成肽疫苗是一种完全的行列式的氨基酸序列或病原体的抗原表位开发设计的一类疫苗，不存在毒力的反弹或灭活不全等这些问题。根据天然氨基酸序列的蛋白质的一级结构，然后通过化学方法人工合成的含有小肽表位，通常包含一个或多个T细胞表位和B细胞表位。特别是那些不能在体外培养病原微生物从而来得到足够数量的抗原，但在免疫病理作用和潜在的致病性病原体等关系到安全性和有效性的问题上有巨大的意义。合成肽疫苗的研究最早的就是在口蹄疫病毒上研究的，合成肽疫苗单独的T细胞表位和B细胞表位的组合是研究合成肽疫苗的最主要研究方向要点，虽然在进度上获得了一些进展，但是没有找出一种满意的合成肽疫苗。合成肽疫苗免疫研究没有获得成功最主要的问题就出在组织相容性复合体（MHC）的限制上面，口蹄疫病免疫主要是依赖体液免疫来完成整个免疫过程的，单一的靠B细胞保护机体的作用是很小的，许多专家学者开始想办法从引进T细胞表位提高免疫原性的多肽入手，这样来研究应该具有非常重要的现实意义的。但被限制由MHC病毒蛋白的T细胞表位的鉴定，TLL的特定的抗原决定簇或引入非选择性T11抗原表位的不同部分可以在很大程度上解决这个问题。要评价合成肽疫苗的效果好还是不好，必须从各个不同的角度着手，如疫苗本身完全不像蛋白质抗原，可诱导各种免疫反应的免疫原性，缺乏集体的多种免疫反应，B细胞和T细胞表位的协同作用困难：因为它缺乏足够多的B细胞表位抗原的刺激。DOEL（1990）用A型、O型、C型口蹄疫病的病毒在VPL序列200-213和141-158肽40个氨基酸组成的合成肽，实验在每个牛和豚鼠动物，可以产生很高滴度的特异性病毒中和抗体，C型保护较差，同源病毒O型和A型肽可以完全保护豚鼠免受各种攻击。Wang等（2002）使用大量的侧翼序列和VPL GH作为实验框架，然后把常见的残留物进入该地区的高整合位点的VPL合成肽疫苗，Th位点设计和引入外源性在猪体内进行免疫，可以有效地得到20/21台湾株口蹄疫病攻毒的保护率。

总之，在口蹄疫防控方面疫苗免疫是至关重要，研究疫苗工作还有很大提升空间，学术界科学家正在研究新型疫苗来解决现阶段现有疫苗免疫缺陷问题，我们相信通过各方面的努力，一定会达到净化消灭该病。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.001