UPLC-PDA法测定慢性应激抑郁大鼠灌胃药对枳壳厚朴后吸收入血、胃肠及脑组织的成分

熊新贵，邢之华，黄　卫，聂课朝，刘海涛，王　杨，杨　波，张春虎，范　荣

(中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008)



UPLC-PDA法测定慢性应激抑郁大鼠灌胃药对枳壳厚朴后吸收入血、胃肠及脑组织的成分

熊新贵，邢之华，黄卫，聂课朝，刘海涛，王杨，杨波，张春虎，范荣

(中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008)

目的测定传统药对枳壳厚朴中主要活性成分及连续灌胃枳壳厚朴药对7周可被慢性应激抑郁大鼠血清、胃肠及脑组织吸收的成分。方法建立UPLC-PDA测定的新方法，色谱条件为Waters Acquity UPLC BEH(R)C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈(A)和0.5%醋酸水(B)；梯度洗脱方法；流量0.3 mL/min，柱温40 ℃；检测波长300 nm。同步定性测定枳壳厚朴药对中的主要7种成分及灌胃该方7周后慢性应激抑郁大鼠血清、胃肠及脑组织中的吸收成分。结果在12 min内，该药对中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、和厚朴酚及厚朴酚7种成分获得良好分离，这7种成分均可被慢性应激抑郁大鼠胃肠组织吸收，仅橙皮苷及水合橙皮内酯可被慢性应激抑郁大鼠血清及脑组织吸收。各成分的LOD在0.12×10-3～1.32×10-3μL/mL，信噪比(S/N)≥3。结论该方法简单、准确、灵敏，为传统药对枳壳厚朴的质量控制及其抗抑郁、促胃肠动力作用机制的深入研究奠定了分析方法学基础。

枳壳；厚朴； UPLC-PDA； 抑郁；大鼠； 胃肠组织；脑组织

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeckr的干燥幼果，性微寒，味苦、辛、酸，具有理气宽胸、行滞消胀的功效，是中医常用理气药。厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮，味苦、辛，微温，归脾、胃、肺、大肠经，具有行气消积、燥湿除满、降逆平喘的功效。枳壳、厚朴为传统中药药对，临床上常用来治疗功能性消化不良、胃肠胀气、术后胃肠功能的恢复等[1]。近期有研究表明枳壳、厚朴亦具有抗抑郁作用[2-5]。而抑郁症常与功能性胃肠病共病[6-7]，脾胃在抑郁症的发生、发展与治疗过程中均发挥着重要作用[8]，因而调理脾胃气机对治疗抑郁症具有重要作用。而中药成分多样且中药复方中成分愈加复杂，研究者普遍认为中药复方获得疗效的关键是能够到达作用部位且复方中某些重要成分可被吸收[9-10]。故本研究探讨了枳壳、厚朴药对的质量控制及慢性应激抑郁大鼠长期灌服此药对后可被大鼠血清、胃肠组织及脑组织吸收的成分，从而为下一步研究奠定基础。

1　实验资料

1.1仪器超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC system,美国Waters公司)，Empower色谱工作站，包括二元溶剂管理系统、样品处理器、柱温箱、自动进样器、PDA检测器；SIGMA2-16K离心机(北京华威中仪科技有限公司)；旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；LGJ-10冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；HGC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。

1.2试剂柚皮苷、柚皮芸香苷、新橙皮苷、橙皮苷、和厚朴酚及厚朴酚标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司，水合橙皮内酯购自美国Sigma公司，纯度均≥98%。甲醇和乙腈(tedia公司，美国俄亥俄州)。

1.3药品及制备枳壳、厚朴均购于湖南省长沙市湘雅路老百姓大药房，经过中南大学中西医结合研究所鉴定，样品凭证存于中南大学中西医结合研究所。枳壳、厚朴按照1∶1的比例称质量，混合，第1次煎煮：生药与水按1∶8(g/mL)比例，煎煮之前浸泡30 min，煮沸后煎煮30 min，然后8层纱布过滤获得药液；第2次以1∶6比例重复煎煮。将2次煎煮过滤后的药液合并，60 ℃旋转蒸发浓缩，冻干，得率为25.62%，冻干粉密封保存于4 ℃冰箱内备用。

1.4动物及慢性应激抑郁大鼠模型的建立采用雄性SD大鼠进行实验，体质量150～180 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号：SYXK(湘)2011-0003，实验前在饲养室正常饲养2周，室温(22±2)℃，湿度(60±4)%，按照昼夜各12 h循环，白天7：00—19：00，食物及水自由摄取。除空白组外，模型组接受7周应激刺激，包括：摇晃5 min/d，每天2次，不定时；禁水24 h；禁食24 h；夹尾1 min/d，每天2次，不定时；电击足底，每次10 s，间隔1 min；冰水游泳15 min/d；噪声刺激；转换昼夜节律24 h；制动。实验过程中每天上午给药(枳壳厚朴汤剂按20 mg/kg剂量给予)，下午或晚上给予相应刺激[11]，上述刺激每天1种，连续2 d内动物所接受的处理不能相同。

1.5检测方法

1.5.1色谱条件Waters Acquity UPLC BEH(R)C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈(A)和0.5%醋酸水(B)；梯度洗脱：14%A∶86%B(初始)，20%A∶80%B(3 min)，17%A∶83%B(4 min)，18%A∶82%B(5 min)，6%A∶94%B(7 min)，40%A∶60%B(9 min)，60%A∶40%B(10 min)，80%A∶20%B(12 min)，100%A∶0%B(13 min)。流量0.3 mL/min，柱温38 ℃，检测波长300 nm，进样量3 μL。

1.5.2溶液的配置①标准品溶液的配置：将7种标准品精确称质量，分别用甲醇溶解制成标准品溶液；将各种标准品溶液稀释、混合溶解成适宜浓度的7种标准品混合母液；标准品溶液与混合标准品溶液均保存在棕色容量瓶中，置于4 ℃冰箱待用。②样本溶液的配置：将药对枳壳厚朴中药冻干粉稀释溶解为3.2 mg/mL(生药/水)，样本绝对进样量3 μL。

1.5.3生物样本的制备①血清样本的取得：大鼠造模完成后，先注射乙醚进行麻醉，从下腔静脉注射肝素，从门静脉取血，以3 000 r/min的速率离心分离，取上清液，存于-20 ℃待测。血清样本的处理：将上述方法取得的上清液常温溶解后分别加入6 mL乙醚及50 μL 1 mmol/L HCl，摇匀1 min，15 000 r/min离心15 min。取上清液在常温下挥发干，加入100 μL甲醇，15 000 r/min离心15 min。再取上清液经0.22 μm混合纤维素脂微孔滤膜滤过，即得，样本进样量3 μL。② 胃肠组织样本的取得：大鼠造模完成后，断头处死，快速将胃及小肠组织取出，用4 ℃生理盐水漂洗，除去血液、滤纸拭干，放置-40 ℃冰箱保存待用。胃肠样本的处理：精密称量胃及小肠组织，按组织和4 ℃双蒸水1∶2比例配置匀浆液；将胃及小肠组织用手术剪剪碎，转移已被剪碎的组织至玻璃匀浆器中匀浆；将匀浆完毕后获得的组织匀浆液保存至-40 ℃冰箱中；将组织匀浆液与甲醇按1∶1的比例配置溶液，涡旋8 min，超声溶解20 min，15 000 r/min离心15 min，取上清液，氮吹仪(60 ℃水浴)吹干，再次加入适量甲醇，重复上述步骤，最终取得的上清液总液体体积60 μL，取3 μL直接进入UPLC测定。③ 边缘系统脑组织样本的取得：造模完成后立即取出大鼠边缘系统脑组织，称质量后加5 mL生理盐水，用玻璃研钵研磨。脑匀浆以2 500 r/min的速率离心分离，取上清液存于-20 ℃待测。边缘系统脑组织样本的处理：组织匀浆液与甲醇按1∶1的比例配置溶液，涡旋8 min，超声溶解20 min，15 000 r/min离心15 min，取上清液，氮吹仪(60 ℃水浴)吹干，再次加入适量甲醇，重复上述步骤，样本绝对进样量3 μL。

2　结　　果

通过超高效液相色谱系统，依据标准品与枳壳厚朴汤剂中对应成分的保留时间及特征性紫外光谱，在不足12 min内，7种成分获得良好分离，7种标准品、枳壳厚朴汤剂及慢性应激抑郁大鼠灌胃枳壳厚朴汤剂7周后血清、胃肠组织及边缘系统脑组织的典型色谱图见图1～6。慢性应激抑郁大鼠灌胃7周后7种成分均可被大鼠胃肠组织吸收，仅橙皮苷及水合橙皮内酯可被慢性应激抑郁大鼠血清及边缘系统脑组织吸收。柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、和厚朴酚及厚朴酚的保留时间依次为3 min 22 s，3 min 24 s，3 min 46 s，3 min 58 s，4 min 16 s，10 min 56 s及11 min 6 s。7种成分的LOD按色谱出现时间依次为1.32，1.16，0.16×10-3，0.26×10-3，0.12×10-3，0.17，0.26 μL/mL。

3　讨　　论

枳壳、厚朴为传统中药药对，药对是我国历代医家长期医疗实践的经验总结, 组成简单却具备传统中药配伍的基本特征，是复杂方剂组成的基础。枳壳有促胃肠动力、抗消化不良、抗氧化和消炎作用[12-13]，其主要成分为柚皮苷、柚皮芸香苷、新橙皮苷、橙皮苷及水合橙皮内酯[14-16]。厚朴具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化及抗抑郁作用，其主要成分为和厚朴酚及厚朴酚[17-18]。中药成分复杂多样，有大分子的和小分子的，有无机的和有机的，这些成分构成了中药的最基本的物质基础。中药药效物质基础研究是阐释中药整体功效及其作用本质的核心环节，是中药安全、有效和质量控制的重要基础[19]。而研究者普遍认为中药发挥药效的直接物质应该在体内，首先必须明确吸收进入体内的中药来源成分，尤其是能到达作用部位的成分[9-10]。

1为柚皮芸香苷；2为柚皮苷；3为橙皮苷；4为新橙皮苷；5为水合橙皮内酯；6为和厚朴酚；7为厚朴酚

1为柚皮芸香苷；2为柚皮苷；3为橙皮苷；4为新橙皮苷；5为水合橙皮内酯；6为和厚朴酚；7为厚朴酚

1为柚皮芸香苷；2为柚皮苷；3为橙皮苷；4为新橙皮苷；5为水合橙皮内酯；6为和厚朴酚；7为厚朴酚

1为柚皮芸香苷；2为柚皮苷；3为橙皮苷；4为新橙皮苷；5为水合橙皮内酯；6为和厚朴酚；7为厚朴酚

3为橙皮苷； 5为水合橙皮内酯

3为橙皮苷； 5为水合橙皮内酯

本研究通过新建立的UPLC-PDA方法，在不足12 min内，同步测定枳壳厚朴汤剂中7种成分和慢性应激抑郁大鼠灌胃该方7周后血清、胃肠组织及边缘系统脑组织的吸收成分，结果显示枳壳厚朴的主要成分在制剂与生物样本中获得良好分离，均在最低检测限范围以上，柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、和厚朴酚及厚朴酚这7种成分均可被慢性应激抑郁大鼠胃肠组织吸收，仅橙皮苷及水合橙皮内酯可被慢性应激抑郁大鼠血清及脑组织吸收。该方法准确度高、灵敏度好、样品前处理简单，为传统药对枳壳厚朴的质量控制及其抗抑郁、促胃肠动力作用机制的深入研究奠定了分析方法学基础。

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UPLC-PDA determination of compounds absorbed in blood, gastrointestinal and brain tissues by chronic unpredictable stress induced depression rats after administration of Zhiqiao-Houpu herb pair

XIONG Xingui, XING Zhihua, HUANG Wei,NIE Kechao, LIU Haitao, WANG Yang,YANG Bo, ZHANG Chunhu, FAN Rong1

(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan,China)

Objective It is to simultaneously qualitative determinate the absorbed compounds in blood, gastrointestinal and brain tissues by chronic unpredictable stress induced depression rats after seven weeks’ administration Zhiqiao-Houpu herb pair (ZQHPHP). Methods A novel UPLC-PDA method was established to simultaneously determinate the compounds in ZQHPHP and those absorbed in blood, gastrointestinal tissue and brain tissue after administration of ZHHPHP for seven weeks. The components were separated with Waters Acquity UPLC BEH(R)C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm) with a flow rate of 0.3 mL/min at 40 ℃ and detected at 300 nm. The mobile phase contained A-acetonitrile and B-0.5% acetic acid with gradient elution. Results Seven compounds in ZQHPHP were well separated including narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin, meranzin hydrate, honokiol and magnolol within 12 minutes which could be absorbed in gastrointestinal tissue by CUSIDR. However only hesperidin and meranzin hydrate can be absorbed in blood and brain tissue by CUSIDR. LODs of component (μL/mL) were 0.12×10-3-1.32(S/N≥3)． Conclusion The method is quick and sensitive which lays the foundation for the quality control of the above compounds in ZQHPHP and helps to further elucidating the mechanism behind its antidepressant and prokinetic effects.

Zhiqiao-Houpu herb pair; UPLC-PDA; depression rats; gastrointestinal and brain tissues; cerebral tissue

熊新贵，女，博士，主治医师，研究方向为消化系统疾病研究。

黄卫，E-mail：huangweidavid@aliyun.com

国家自然科学基金青年基金项目(81303098)；湖南省科技厅社会发展支撑计划项目(2015SK20322)；湖南省中管局一般项目(201596)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.25.002

R-332

A

1008-8849(2016)25-2741-04

2016-03-10