高压氧诱导神经病理性疼痛大鼠自噬的作用

韩光，李璐，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004）

·论著·

高压氧诱导神经病理性疼痛大鼠自噬的作用

韩光，李璐，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004）

目的探讨高压氧能否诱导自噬产生抗神经病理性疼痛作用，从一个全新的角度验证高压氧镇痛的有效性。方法选取60只雄性SD大鼠，随机均分为4组：对照组（C组）、假手术组（S组）、坐骨神经慢性缩窄组（CCI组）和高压氧组（HBO组）。在大鼠术后7 d取脊髓标本，采用Western blot方法检测微管相关轻链蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）及泛素结合蛋白P62表达，在电镜下观察各组大鼠脊髓线粒体自噬的变化情况。结果Western blot显示CCI组、HBO组大鼠脊髓中LC3Ⅱ及P62含量较C组、S组增加（P＜0.05），而C组与S组之间比较无统计学差异（P＞0.05）。HBO组LC3Ⅱ表达较CCI组增加（P＜0.05），而CCI组P62表达比HBO组显著增加（P＜0.05）。电镜下，与C组、S组比较，CCI组、HBO组脊髓小胶质细胞的自噬明显增高（P＜0.05），且C组与S组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论高压氧能诱导自噬，从而产生抗神经病理性疼痛作用。

高压氧；慢性结扎；坐骨神经；p62；微管相关蛋白1轻链3；线粒体；自噬

自噬是真核细胞进化过程中一种保守的细胞行为，在维持细胞稳态方面占有极其重要的地位。近年来，人们发现肿瘤及多种中枢神经系统病变（脑缺血、脊髓外伤等）自噬细胞产生增多，并对中枢神经系统发挥保护作用。然而目前自噬对神经性病理性疼痛作用报道很少。最近有研究［1］发现自噬可能与神经病理性疼痛有关，认为疼痛的发生、发展均由于自噬调节失衡所致。然而自噬究竟在神经病理性疼痛中发挥着什么作用，高压氧能否诱导其产生尚不清楚，本研究拟通过观察脊髓小胶质细胞的自噬来探讨高压氧抗神经病理性疼痛的作用。

1　材料与方法

1.1一般资料

雄性SD大鼠60只，体质量280～350 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。随机均分成4组：对照组（C组，不进行操作）、假手术组（S组，暴露坐骨神经但不结扎）、坐骨神经慢性缩窄组（CCI组，单侧坐骨神经结扎）、高压氧组［HBO组，慢性坐骨神经结扎（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI），术后连续进行高压氧治疗5 d］。

1.2方法

1.2.1CCI模型的制备：大鼠腹腔麻醉后，在右侧股骨后分离坐骨神经，用丝线做3个松弛结扎，使神经外膜稍有压力。成功标准：右后腿肌肉出现短阵收缩。缝合皮肤后回笼观察。S组大鼠仅暴露但不结扎。

1.2.2大鼠的高压氧处理：HBO组大鼠连续5 d进入高压氧舱内行高压氧治疗，进舱后舱内的氧浓度为90%以上，压力为0.25 MPa，以匀速增加或减少压力。其他组大鼠也放在舱内，除高压氧的压力、O2浓度不同（压力为标准常压，氧浓度为正常21%）外，其他条件均相同。

1.2.3取材：腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉，行升主动脉插管，灌注0.9%的生理盐水，使流出液为清凉无色液体，保留大鼠L4～L6脊髓，一部分放在-80℃冰箱保存，剩下的浸泡在4%多聚甲醛中待用。

1.2.4Western blot方法测定组织中微管相关蛋白1轻链 3Ⅱ（microtubulerassociated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）及泛素结合蛋白P62表达：用SDSPAGE凝胶试剂盒和ECL发光法试剂盒制胶、电泳、转膜、显色，成像拍照，所有条带用Image J分析结果，记录每条蛋白电泳带的光密度值。LC3Ⅱ及P62与内参之比计为各自蛋白表达量。

1.2.5电子显微镜观察自噬体含量：新鲜标本用4%多聚甲醛固定4 h，常规固定、脱水、浸蜡、包埋制作石蜡切片，制作半薄切片。再甲苯胺蓝染色，制作超薄切片。饱和的醋酸铀-柠檬酸铅将切片行双重染色，自然干燥。透射电镜下观察组织超微结构，各组每只大鼠取10个视野，记录自噬体的数量。

1.3统计学方法

2　结果

2.14组大鼠脊髓LC3Ⅱ及P62的蛋白表达比较

结果显示：CCI、HBO组的大鼠脊髓LC3Ⅱ及P62的表达含量较C组、S组增加（P＜0.05），而C组与S组之间无统计学差异（P＞0.05）。HBO组的

LC3Ⅱ表达较CCI组增加（P＜0.05），而CCI组的P62表达比HBO组增加（P＜0.05）。见表1、图1。

2.24组大鼠电镜下脊髓小胶质细胞自噬情况比较

电子显微镜下观察大鼠脊髓小胶质细胞发现，C组、S组、CCI组、HBO组自噬体数目分别为0.008、0.009、0.045、0.059/μm2。与C组、S组比较，CCI组、HBO组的线粒体自噬体数目明显增高（P＜0.05），而C组与S组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图2。

3　讨论

神经病理性疼痛本身是一种慢性缺血缺氧损伤，细胞遭受低氧刺激时，线粒体电子传递链中最终受体的氧分子供应不足，对细胞大分子和细胞器造成损伤，最终导致细胞功能紊乱或细胞死亡。氧化应激反应是神经病理性疼痛发病的重要机制，在这一过程中，细胞自噬参与多种炎性介质基因编码，促进疼痛相关细胞的增殖，对疼痛发挥着重要的作用［2］。自噬在维持细胞形态结构、代谢和细胞功能的自身稳态方面发挥着重要的作用。在生理状态下它处于较低水平，当机体受到应激刺激（如创伤、缺血缺氧等）自噬会被激活［3，4］。LC3是细胞中酵母基因的同源物，当自噬发生时LC3随之增加，亚型LC3Ⅱ含量与自噬体数量成正比，因此LC3Ⅱ成为检测自噬体的一个特异性标记物［5，6］。另外，由于P62通过与LC3结合转入自噬体，被自噬溶酶体降解，P62的蓄积增高常提示自噬受到抑制［7］。

表1　4组大鼠脊髓LC3ⅡP62蛋白表达比较Tab.1　Com parison of LC3Ⅱ and P62 protein expression inspinal cord o f rats in each g roup

图1　4组大鼠LC3Ⅱ及P62的蛋白表达比较Fig.1　The protein exp ression of LC3Ⅱand P62 in each groupdeterm ined by Western blot

图2　电镜下各组小胶质细胞形态×5 000Fig.2　The m orphology of m icroglia in each group under electron m ic roscopy

高压氧作为一种有效无创的治疗手段增加脊髓的氧分压，提高抗氧化酶活性，缓解疼痛并减少不良反应［8］。Yan等［9］已将高压氧广泛应用于脊髓缺血耐受等领域。前期研究［10］已通过疼痛行为学评分证明了高压氧对神经病理性疼痛治疗的有效性，并证实它可减少坐骨神经慢性缩窄大鼠脊髓中iNOS、nNOS及小胶质细胞的表达。由于高压氧能有效清除氧自由基，对抗氧化应激的不良反应，因此推测高压氧可能诱导自噬的产生。

本实验发现，和CCI组比较，HBO组大鼠脊髓小胶质细胞LC3Ⅱ表达增高，而P62的表达较低，说明HBO组脊髓自噬处于活跃的较高水平，可能是高压氧的一种保护性效应。尽管CCI组自噬不像HBO组那样处于很高水平，但也诱导自噬产生，可能是脊髓本身受损后的一种应激反应。有文献［11］报道自噬将作为一种衡量治疗神经病理性疼痛方法有效性的一种方式或手段。本结果显示自噬主要表达在CCI组及HBO组，且HBO组表达得更明显。此结果从自噬角度再次证明高压氧抗神经病理性疼痛的有效性，也为高压氧抗神经病理性疼痛机制研究开辟了一个新思路。但此结果仅是术后第7天的对比，很难看出高压氧对自噬影响的变化趋势，在后续研究中还应就不同时间进行比较。

综上所述，在神经病理性疼痛的过程中可以产生自噬，随着疼痛的发展，高压氧可以增强这种保护性自噬，并成功诱导自噬体延续。但具体如何作用于自噬体及其机制还需进一步深入研究。

［1］Feng T，Yin Q，Weng ZL，et al.Rapamycin ameliorates neuropathic pain by activating autophagy and inhibiting interleukin-1β in the rat spinal cord［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2014，34 （6）：830-837.

［2］Marinelli S，Nazio F，Tinari A，et al.Schwann cell autophagy counteracts the onset and chronification of neuropathic pain［J］.Pain，2014，155（1）：93-107.

［3］Shi G，Shi J，Liu K，et al.Increased miR-195 aggravates neuropathic pain by inhibiting autophagy following peripheral nerve injury［J］. Glia，2013，61（4）：504-512.

［4］Rangaraju S，Verrier JD，Madorsky I，et al.Rapamycin activates autophagy and improves myelination in explant cultures from neuropathic mice［J］.J Neurosci，2010，30（34）：11388-11397.

［5］Zhang E，Yi MH，Ko Y，et al.Expression of LC3 and Beclin 1 in the spinal dorsal horn following spinal nerve ligation-induced neuropathic pain［J］.Brain Res，2013，1519（6）：31-39.

［6］Li X，Lin X，Ma H.Overexpression of LC3 in papillary thyroid carcinomas and lymph node metastases［J］.Acta Chir Belg，2015，115 （5）：356-363.

［7］Hua F，Hu ZW.TRIB3-P62 interaction，diabetes and autophagy ［J］.Oncotarget，2015，6（33）：34061-34062.

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［9］Yan W，Fang Z，Yang Q，et al.SirT1 mediates hyperbaric oxygen preconditioning-induced ischemic tolerance in rat brain［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（3）：396-406.

［10］Han G，Li L，Meng LX.Effects of hyperbaric oxygen on pain-related behaviors and nitric oxide synthase in a rat model of neuropathic pain［J］.Pain Res Management，2013，18（3）：137-141.

［11］Jung KT，Lim KJ.Autophagy：Can it be a new experimental research method of neuropathic pain？［J］.Korean J Pain，2015，28 （4）：229-230.

（编辑武玉欣）

HyperbaricOxygen Induced Autophagy in Neuropathic Rats

HANGuang，LILu，ZHAOPing
（DepartmentofAnesthesiology，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether hyperbaric oxygen（HBO）affected neuropathic pain through autophagy and verify the HBO effect. M ethods A totalof60maleSD ratswereselected for thestudyand randomlydivided into4groups：controlgroup（Cgroup），sham operationgroup （S group），chronic constriction group（CCI group）and hyperbaric oxygen group（HBO group）.LC3Ⅱand P62 were determined by Western blot method and the autophagy was detected by electron microscopy on the 7th day.ResultsCCI and HBO groups were significantly higher than C and S group in Western blot（P＜0.05）.There was no difference between group C and group S（P＞0.05）.The expression of LC3Ⅱin HBO group was significantly higher than that in CCI group（P＜0.05）.And the expression of P62 in CCI group was significantly higher than that in HBO group（P＜0.05）.The autophagy in CCI and HBO group were significantly increased comparing to the C and S groups（P＜0.05）.However，the difference betweengroup Cand Swasnotsignificant（P＞0.05）.ConclusionHyperbaric oxygen therapy can induceautophagy foranti-neuropathic pain.

hyperbaric oxygen；chronic constriction injury；the sciatic nerve；P62；microtubulerassociated protein 1 light chain 3；mitochondria；autophagy

R614

A

0258-4646（2016）04-0349-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.015

沈阳市科学技术计划（F15-199-1-35）

韩光（1978-），女，副教授，硕士.

赵平，E-mail：zhaop@sj-hospital.org

2015-10-12

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