尿RBP胶乳增强免疫比浊检测方法的建立及性能评价

俞俊文,刘献文

(1.新疆维吾尔自治区叶城县人民医院，新疆喀什 844900 2.宁波美康生物科技股份有限公司，浙江宁波 315105)



·临床研究·

尿RBP胶乳增强免疫比浊检测方法的建立及性能评价

俞俊文1,刘献文2

(1.新疆维吾尔自治区叶城县人民医院，新疆喀什 844900 2.宁波美康生物科技股份有限公司，浙江宁波 315105)

目的根据胶乳增强免疫比浊原理，建立一种尿视黄醇结合蛋白(RBP)检测方法。方法将RBP多克隆抗体标记到胶乳微球表面，利用抗原抗体凝集反应原理，建立了尿RBP免疫检测方法，并对本方法进行了精密度、准确度、线性、稳定性试验和相关性试验。结果本检测方法的灵敏度为0.2 mg/L，对浓度为1.07 mg/L的低值质控品重复测定20次，其精密度为2.28%；线性范围为0.5～10.0 mg/L，对高、低浓度质控品的相对偏差为-6.03%和-2.95%，与RBP酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒的决定系数R2为0.998 6。结论该研究建立了尿RBP胶乳增强免疫比浊检测方法，各项性能指标均达到临床检测要求，可用于临床尿RBP浓度的检测。

尿视黄醇结合蛋白；胶乳增强免疫比浊法；精密度；准确度

视黄醇结合蛋白(RBP)是由肝脏合成，自由通过肾小球，由肾小管近曲端上皮细胞重吸收并降解[1-2]。尿RBP浓度升高，提示肾小管近曲端重吸收功能障碍。尿RBP浓度与肾小管间质损坏程度呈明显正相关，可作为检测肾小管的病变病程，指导治疗和判断预后的一项灵敏的生化指标[3-4]。目前国内RBP检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫比浊法，其中ELISA操作复杂，不能实现自动化检测；而免疫比浊法的灵敏度低。本研究利用胶乳增强免疫比浊原理，建立了一种尿RBP检测方法，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2014年11月1～30日叶城县人民医院肾病患者尿标本45例，其中男20例，年龄25～50岁；女25例，年龄30～55周岁。

1.2仪器与试剂RBP多克隆抗体、RBP质控品、胶乳微球均为宁波美康生物科技股份有限公司提供。采用RBP ELISA检测试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)，7180型全自动生化分析仪(日本日立公司)进行检测。

1.3方法

1.3.1胶乳微球的活化用50 mmol/L pH6.0的MES缓冲液稀释胶乳,稀释至乳胶微球体积分数为2%，取100 mL，加入碳二亚胺(EDAC)100 mg，室温反应1 h，离心6 000 r/min 15 min，去上清液，沉淀悬浮于50 mmol/L pH6.0的MES缓冲液中，超声分散；再次离心，去上清液，沉淀悬浮于50 mmol/L pH6.0的MES缓冲液中，超声分散。

1.3.2胶乳微球的致敏边搅拌边加入10 mg RBP抗体，室温反应1 h。6 000 r/min离心15 min，去上清液，沉淀悬浮于50 mmol/L pH6.0的MES缓冲液中，体积分数为1%，超声分散，加入2%牛血清白蛋白(BSA)，4 ℃封闭过夜。离心去上清液，用分散液(50 mmol/L pH7.5的三羟甲基氨基甲烷+1% BSA+0.1%叠氮化钠)溶解胶乳，体积分数为0.2%，超声分散。

1.3.3性能评价测定仪器采用日立7180全自动生化分析仪，分析方法为两点终点法。分析参数R1为240 μL，R2为60 μL，标本为10 μL；波长为546 nm。测定步骤：先加入R1和标本，于37 ℃孵育5 min后，加入R2，立即读取第一点吸光度值，计时反应5 min后，读取第二点吸光度值，计算两点吸光度差值。定标曲线制作：以定标液浓度为横坐标，各浓度定标液对应的吸光度差值为纵坐标，做logit-log(4p)函数曲线。标本浓度计算方法：根据标本的吸光度值差值，代入定标曲线，计算相对应的浓度值。

2　结　　果

表1　　灵敏度分析

2.2精密度测试将高、低浓度质控品各重复测定20次，计算精密度。本检测方法精密度为≤10%。采用胶乳增强免疫比浊检测法检测质控品在高(4.51 mg/L)、低(1.07 mg/L)两种浓度下的测量值，各重复测定20次，计算精密度。本检测方法精密度为≤10%。结果显示，在高、低两种浓度下的精密度分别为1.57%、2.28%。

2.3准确度测试重复测定高、低浓度的两份质控品，各重复测定3次，计算相对偏差。本检测方法检测质控品的相对偏差≤10%，说明方法具有很好的准确度。见表2。

表2　　准确度分析

2.4线性范围测试将RBP为10 mg/L的高浓度尿标本用生理盐水按照1.00、0.95、0.90、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05的稀释比例进行稀释，每个浓度重复测定3次。以稀释比例为横坐标，以测定值为纵坐标作图，进行线性相关性分析。本检测方法对尿标本RBP的检测范围为0.5～10.0 mg/L。见图1。

图1　　检测试剂线性分析

2.5抗干扰性在同一份人血清标本中分别加入不同浓度的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值与加入干扰物质前的测定值之间的差值除以加入干扰物前的测定值比值即为干扰率。分别加入以下5种干扰物质，其结果为：(1)结合胆红素添加量为0.0、37.5、75.0、100.0、150.0 mg/dL，干扰率分别为0.0%、0.0%、-1.0%、1.0%、-0.2%；(2)血红蛋白添加量为0.0、125.0、250.0、375.0、500.0 mg/L，干扰率分别为0.0%、0.7%、-0.4%、-1.1%、-2.1%；(3)维生素C(VC)添加量为0.0、7.5、15.0、22.5、30.0 mg/L，干扰率分别为0.0%、-1.4%、-0.3%、-2.0%、-2.4%；(4)葡萄糖添加量为0.0、250.0、500.0、750.0、1 000.0 mg/L，干扰率分别为0.0%、0.2%、0.5%、1.0%、1.4%；(5)尿微量白蛋白(mAlb)添加量为0.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/L，干扰率分别为0.0%、0.0%、0.0%、0.0%、0.0%。试验结果表明结合胆红素、血红蛋白、VC、葡萄糖和mAlb的浓度分别在150.0、500.0、30.0、1 000.0、100.0 mg/dL时，它们对测定结果的干扰率均在3%以下。

2.6相关性分析采用本检测方法和RBP ELISA检测试剂盒，分别对45份人尿液进行测定，本检测方法和对照试剂的决定系数R2为0.998 6，建立回归方程Y=1.008 7X-0.029 8。该结果表明检测方法与对照试剂具有很好的相关性。见图2。

图2　　两种方法检测值的回归直线

3　讨　　论

随着社会环境和自然环境的日益变化，以及人口结构的老龄化，高血压、糖尿病、冠心病、恶性肿瘤等慢性疾病已经成为危害国人健康的主要疾病。这些慢性疾病最容易累积肾脏，引起肾脏的病变。由于当前国内基层医疗机构的资源配备不足，导致慢性基础疾病的控制不佳或者不断进展，肾脏也在不知不觉中发生损伤，然而其强大的代偿能力使得肾脏的慢性损伤缺乏明显的临床症状。由于临床表现隐匿，往往不易早期发现，也失去了最好的干预治疗时机。因此早期的肾脏诊断指标就显得尤为重要。

目前，评价肾小管损伤的内源性指标主要有N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)等[5-6]。以上标志性蛋白均受诸多因素影响，限制了其临床应用价值。NAG主要分布于近段小管上皮细胞中，尿NAG主要由肾小管上皮细胞破损，溶酶体破裂后释放所致。肾小管轻微受损时，肾小管上皮细胞受损但没有大量溶酶体破裂，从而使尿中NAG浓度较低，不能准确地反映肾小管间质损害程度[7]。β2-MG是有体内有核细胞产生，其血中浓度易受慢性炎症、肝病、肿瘤、病毒感染等影响而升高，肾小管重吸收β2-MG的阈值为5 mg/L，当非肾性疾病导致β2-MG合成显著增多时，血中浓度超过阈值，可出现肾小管非重吸收功能受损的β2-MG尿，血清和尿中均可增高，影响了其特异性；而且β2-MG在酸性尿中极不稳定，影响了其检测准确度[8-9]。

而RBP是肝脏合成并分泌的一种低分子量蛋白，游离的RBP能迅速被肾小球滤过，几乎全部被肾近曲小管重吸收而分解，尿液中RBP含量甚微。正常情况下，RBP在尿液中性能稳定，不易分解，不受尿pH值和血压的影响，当肾近曲小管损伤时，其尿液中含量明显增加。尤其当慢性肾病患者近端肾小管有损伤时，血β2-MG以及内生肌酐清除率尚在正常范围内，RBP排泄量便有明显增加。因此RBP是较为理想的反映肾小管间质受损的敏感特异性标志物，对诊断肾小管间质受损及受损程度、监控治疗效果具有重要的应用价值和临床意义[10-13]。

综上所述，本研究采用胶乳增强免疫比浊原理建立了尿RBP检测方法，具有良好的灵敏度、精密度、线性、准确度和相关性。并且在全自动生化仪上进行尿RBP检测操作简便、价格低廉、适合常规检测，与其他指标联合检测能为肾脏损伤的部位和程度提供更准确的诊断依据，值得临床推广应用。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.054

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1673-4130(2016)17-2481-03

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