CXCR7表达增强促进内皮祖细胞血管生成能力

程鹏，何露清，凌骁，林秀飞，李校堃

（温州医科大学　药学院　中美糖尿病并发症研究所，浙江　温州　325035）



CXCR7表达增强促进内皮祖细胞血管生成能力

程鹏，何露清，凌骁，林秀飞，李校堃

（温州医科大学药学院中美糖尿病并发症研究所，浙江温州325035）

目的：考察提高CXCR7表达能否提高内皮祖细胞（EPCs）血管生成能力。方法：利用高表达CXCR7的腺病毒转染至人脐带血来源的EPCs，建立CXCR7high-EPCs工程化细胞。比较CXCR7high-EPCs与对照组EPCs在无血清条件下存活、黏附、经基质细胞衍生因子-1（SDF-1）诱导的跨内皮迁移、管样结构形成以及一氧化氮（NO）生成能力。结果：高表达CXCR7能显著增强EPCs在无血清条件下细胞存活能力、黏附功能、SDF-1诱导的跨内皮迁移、管样结构形成以及EPCs生成NO的能力，并且与SDF-1有协同作用。结论：提高CXCR7在人脐带血来源的EPCs中表达能够增强其血管生成能力，这为临床治疗血管性疾病提供新思路。

CXCR7；内皮祖细胞；细胞存活；管样结构形成

早在1997年，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）就能够从人的外周血中分离得到［1］。临床研究表明外周血中EPCs的数量和功能与心血管疾病风险及死亡率呈负相关［2-3］。动物实验也表明移植骨髓［4］、脐带血［5］或者外周血［6］来源的EPCs能够改善心肌缺血以及下肢缺血动物模型的血流再恢复情况。基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在EPCs参与血管生成中发挥关键作用［7-11］。近新研究［12-13］发现：SDF-1的受体CXCR7也参与到SDF-1介导EPCs血管生成的过程中。尽管CXCR7在EPCs中表达量很低，但其介导SDF-1诱导细胞存活、与内皮细胞黏附、形成管样结构以及合成一氧化氮（NO）等功能不容忽视。本实验利用携带人CXCR7基因的腺病毒转染EPCs获得CXCR7高表达的EPCs。通过与空载腺病毒转染的EPCs进行比较发现：高表达CXCR7的EPCs其存活能力、黏附功能、跨内皮迁移能力、管样结构形成以及细胞生成NO能力显著得到提升，证明增强EPCs中CXCR7的表达量将显著提高细胞血管生成功能。

1　材料和方法

1.1材料 人脐带血来源于健康产妇；MCDB131培养基购自Gibco公司，人淋巴细胞分离液、荆豆凝集素（FITC-UEA-1）购自Sigma公司，EGM-2培养基购自Lonza公司，乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）购自BT公司，MTT检测试剂盒购自凯基生物公司，CXCR7抗体购自Cell Signaling公司，基质胶购自Corning公司，NO检测试剂盒购自Promega公司；本实验用到超净台、细胞孵育箱、流式细胞仪、倒置显微镜、荧光倒置显微镜、电子天平、细胞超生破碎仪。

1.2方法

1.2.1EPCs的分离与培养：无菌条件下用抗凝血袋获取人脐带血约100 mL，用MCDB131培养基按1∶1的体积比稀释血液，将等体积的人淋巴细胞分离液Histopaque 1077轻微缓慢加至血液上层；500×g离心30 min，取中间白膜层细胞；培养基洗涤细胞后加入Single-Quots的EGM-2（含10% FBS）培养基重悬；铺板于预先用2 μg/cm2人纤维粘连蛋白包被的细胞培养皿中。培养的前7 d每天换液，之后每2 d 换1次液，显微镜下观察细胞形态并摄像。

1.2.2EPCs的鉴定：待EPCs传代后对其进行鉴定，利用细胞免疫荧光实验对细胞中EPCs特异性表面标记CD133及VEGFR-2的表达情况进行检测，并通过Dil-ac-LDL摄取实验和FITC-UEA-1结合实验对细胞进行EPCs内皮功能鉴定。

1.2.3转染：利用实验室设计的携带人CXCR7基因的腺病毒对EPCs进行转染，空载腺病毒转染EPCs作为阴性对照组。转染48 h后，利用免疫印迹实验检测EPCs中CXCR7的表达情况。

1.2.4EPCs凋亡检测实验：CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs培养至细胞密度达80%，并可进行细胞凋亡实验。实验分组情况：CXCR7high-EPCs组和ctrl-EPCs组用无血清的MCDB131培养基进行实验；CXCR7high-EPCs+SDF-1组和ctrl-EPCs+SDF-1组用含100 ng/mL SDF-1的无血清MCDB131培养基进行凋亡实验。EPCs培养48 h后，消化并收集，再用冰冷PBS洗涤2次，采用MTT检测试剂盒并利用流式细胞计数仪检测EPCs凋亡情况。

1.2.5EPCs黏附实验：原代培养出来的人脐静脉内皮细胞以1×105/孔的密度铺板于细胞24孔板中，培养至完全融合；用含有10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL IL-1β的MCDB131培养基处理EPCs 5 h，活化内皮细胞单层；实验分组：CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs加至活化的内皮细胞单层上，加入不含血清的MCDB131；在CXCR7high-EPCs+SDF-1组和ctrl-EPCs+SDF-1实验组中加入含100 ng/mL SDF-1（Peprotech公司）的无血清MCDB131，37 ℃孵育15 min。实验结束后把未黏附的细胞用PBS洗去；荧光显微镜下观察，每个孔随机选取5个视野，对发绿色荧光的细胞进行计数统计。

1.2.6EPCs跨内皮迁移实验：将原代培养的人脐静脉内皮细胞以每孔5×104的密度铺板于细胞24孔板的transwell上腔，然后放在24孔板中培养至完全融合；取对数生长期的EPCs进行消化，PBS重悬；进行细胞计数，尽量保证各组别细胞数量一致；把EPCs加到transwell上腔。往CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs组的transwell下腔中加入无血清的MCDB131，往CXCR7high-EPCs+SDF-1和ctrl-EPCs+SDF-1组的transwell下腔中加入含有100 ng/mL SDF-1的无血清MCDB131，37 ℃孵育12 h，使EPCs穿过内皮细胞单层和transwell膜；孵育12 h后，取出transwell小室，用棉棒刮尽上腔中的细胞。荧光显微镜下，每个transwell孔随机选取5个不同视野，对穿过transwell发绿色荧光的细胞进行计数统计。

1.2.7EPCs管样结构形成实验：将包埋于碎冰中的基质胶放在4 ℃过夜解冻；移液器枪头，48孔板也放在4 ℃预冷；待第2天实验时向预冷的48孔板中每孔加入125 μL基质胶，“8”字型摇动孔板，使胶铺平，放入细胞培养箱中预热30 min，使基质胶充分凝固聚合；取对数生长期的EPCs用无血清MCDB131饥饿处理12 h，排除EGM-2培养基中血清以及生长因子对后续实验的干扰；CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs组别中加入无血清MCDB131；CXCR7high-EPCs+SDF-1和ctrl-EPCs+SDF-1组别中加入含100 ng/mL SDF-1的无血清MCDB131，充分混匀后以每孔2.5×105/mL的细胞密度取250 μL细胞悬液加入48孔板中，37 ℃培养12～24 h。随后把孔板放在光学显微镜下观察、拍照，用Image J测量管样结构的长度并进行统计学分析。

1.2.8EPCs NO检测实验：取各实验组细胞上清液50 μL，加入50 μL Griess Reagent I进行后续测试。空白对照组加60 μL样品稀释液，标准品组加60 μL标准品，实验各组加60 μL各组细胞上清液，将5 μL的NADPH（2 mmol/L）加至所有组别，随后各组加Nitrate Reductase 5 μL，充分混匀，37 ℃孵育30 min；孵育结束后，各组加入10 μL的LDH Buffer，接着加入10 μL的LDH，充分混匀，37 ℃孵育30 min；各组中加入Griess Reagent I、Griess Reagent I I 50 μL，充分混匀后室温孵育10 min，酶标仪在540 nm检测吸光度。进行数据统计学分析。

1.3统计学处理方法 采用SPSS18.0软件进行统计学处理。实验数据以±s表示，同一实验多组间的差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EPCs的分离与培养结果 分离的细胞在人纤维黏连蛋白包被的培养皿中培养7 d后，开始出现典型的细胞集落，随后原本梭形的细胞逐渐消失，最终成铺路石样（见图1A）。通过EPCs特异性表面标记抗体CD133和VEGFR2鉴定该细胞，并运用摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1来鉴定细胞的内皮功能。结果表明原代分离的细胞能够摄取Dil-ac-LDL以及结合FITC-UEA-1（见图1B），并且该种细胞大都表现出CD133和VEGFR2双阳性（见图1C），从人脐带血分离的单个核细胞经过诱导培养可以获得高纯度的EPCs。

图1　EPCs的分离与培养

2.2腺病毒转染获得CXCR7高表达的EPCs 利用实验室构建的携带人CXCR7基因的腺病毒和空腺病毒转染EPCs，获得CXCR7high-EPCs和Ctrl-EPCs模型。免疫印迹实验表明：携带人CXCR7基因的腺病毒在转染EPCs后明显上调细胞中CXCR7的表达量，但对CXCR4的表达并没有影响（P＜0.01），见图2。

2.3提高CXCR7表达增强EPCs存活 不含血清的培养基诱导EPCs凋亡，MTT法检测活细胞数量，计算细胞凋亡率。结果显示：在无血清条件下，CXCR7high-EPCs凋亡率比ctrl-EPCs低；加入外源性的SDF-1能够显著降低CXCR7high-EPCs和ctrl-EPCs的细胞凋亡率。SDF-1存在时，CXCR7high-EPCs的凋亡率与ctrl-EPCs相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。2.4 提高CXCR7表达增强EPCs黏附作用 本研究中通过比较不同CXCR7浓度的EPCs在活化的人脐静脉内皮细胞表面黏附能力，研究提高EPCs中CXCR7的表达在促进与活化内皮细胞黏附的作用。实验结果表明：CXCR7high-EPCs与活化内皮细胞的黏附能力要显著强于ctrl-EPCs；SDF-1能明显增强CXCR7high-EPCs与ctrl-EPCs与活化的人脐静脉内皮细胞的黏附功能，且CXCR7high-EPCs的黏附能力比ctrl-EPCs更显著（见图4）。

图2　不同腺病毒转染对EPCs中CXCR7、CXCR4表达的影响

图3　不同CXCR7表达水平对EPCs在无血清条件下对细胞凋亡率的影响

图4　不同CXCR7浓度对EPCs与活化人脐静脉内皮细胞黏附功能的影响

2.5提高CXCR7表达增强EPCs跨内皮迁移 实验中通过transwell实验比较不同CXCR7表达的EPCs跨内皮单层能力，考察提高CXCR7表达能否促进EPCs跨内皮迁移能力。结果显示：没有SDF-1存在时，CXCR7high-EPCs与ctrl-EPCs的跨内皮迁移能力没有显著差异；在给予SDF-1后，CXCR7high-EPCs与ctrl-EPCs跨内皮迁移能力均得到提升，且CXCR7high-EPCs跨内皮迁移能力也明显强于ctrl-EPCs（见图5）。

图5　不同CXCR7表达水平对EPCs跨内皮迁移能力的作用

2.6提高CXCR7表达增强EPCs管样结构形成 实验通过考察不同CXCR7表达水平的EPCs在基质胶中形成管样结构的能力，研究增加EPCs中CXCR7的表达是否可以促进细胞血管形成。实验结果证实：CXCR7high-EPCs在基质胶中成管能力显著高于ctrl-EPCs；SDF-1能显著促进CXCR7high-EPCs与ctrl-EPCs体外管样结构的形成。SDF-1存在时，CXCR7high-EPCs管样结构形成能力强于ctrl-EPCs，但差异无统计学意义（见图6）。

图6　不同CXCR7表达水平对EPCs体外管样结构形成能力的作用

2.7提高CXCR7表达增强EPCs生成NO的能力 通过比较不同CXCR7表达水平的EPCs生成NO的能力，研究增加CXCR7在EPCs中的表达量是否能上调细胞促血管功能。结果显示：CXCR7high-EPCs组别中NO的含量显著高于ctrl-EPCs；SDF-1诱导能够显著促进CXCR7high-EPCs与ctrl-EPCs产生NO的能力。SDF-1存在的条件下，CXCR7high-EPCs组的NO含量显著高于ctrl-EPCs，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

3　讨论

本实验利用CXCR7高表达的腺病毒转染EPCs，成功建立高表达CXCR7的EPCs模型（CXCR7high-EPCs）。研究发现提高CXCR7表达能够极大程度提高EPCs的存活能力，这与前期研究［13］证明CXCR7单独介导SDF-1诱导EPCs存活的结论保持一致。本研究中给予细胞外源性SDF-1能显著增强CXCR7high-EPCs的黏附及跨内皮迁移能力，并能与高表达的CXCR7发挥协同作用，这与前期研究［13］证明CXCR7单独介导SDF-1诱导EPCs黏附的结论也是一致的，与Zabel等［5］对肿瘤细胞研究结果同样相符。EPCs黏附及跨内皮迁移能力是生成血管的起始步骤，高表达CXCR7促进EPCs与活化的内皮黏附、跨内皮迁移，很可能是由于增强了细胞的血管生成能力。

图7　不同CXCR7表达水平对EPCs生成NO能力的影响

实验中运用管样结构形成实验考察提高CXCR7表达对EPCs成血管能力的影响。结果表明：高表达CXCR7的EPCs其管样结构形成得到显著增强，并与SDF-1发挥协同作用。Watanabe等［14］在炎症研究中发现提高CXCR7表达对内皮类细胞血管生成有促进作用，这与本实验结果相符。最后，通过检测NO含量，结果也表明转染CXCR7的EPCs体内NO生成量显著增加并与SDF-1发挥协同作用，表明CXCR7高表达可能通过提高EPCs合成NO增强其成血管功能。

提高EPCs中CXCR7的表达量显著提高EPCs的存活能力、与活化内皮的黏附功能、SDF-1介导细胞跨内皮迁移能力、管样结构形成能力以及NO生成能力，这种作用与SDF-1一起发挥协同效应。提高CXCR7表达很可能是增强EPCs血管生成能力的有效方法，同时也为改造EPCs用于临床干细胞移植治疗血管性疾病提供新思路。

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（本文编辑：赵翠翠，丁敏娇）

Increasing CXCR7 expression in endothelial progenitor cells can enhances its angiogenic capability

CHENG Peng, HE Luqing, LING Xiao, LIN Xiufei, LI Xiaokun. Sine-American Research Institute for Diabetic Complication, School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate whether increasing CXCR7 expression in endothelial progenitor cells （EPCs） can improve its angiogenic capability. Methods: CXCR7high-EPCs were constructed by transfecting with adenovirus carring human CXCR7 gene. The differences between CXCR7high-EPCs and wt-EPC in cell survival under serum deprivation condition， adhesion， SDF-1 induced trans-endothelial migration， tube formation and nitric oxide （NO） production were compared. Results: Compared with ctrl-EPCs， CXCR7high-EPCs has superiority in cell survival under serum-free condition， cell adhension to activated endothelial cells， trans-endothelial migration， tube formation and NO production， which could be further enhanced by SDF-1. Conclusion: Increasing expression of CXCR7 can enhance the angiogenic capacity of EPCs. The performance of present research may provide a new idea for the treatment of vascular diseases.

CXCR7； endothelial progenitor cells； cell survival； tube formation

R96

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.07.007

2016-02-07

温州市公益性科技计划项目（Y20140654）；国家自然科学基金青年基金资助项目（81200239）。

程鹏（1990-），男，浙江杭州人，硕士生。

李校堃，教授，Email：xiaokunli@163.net。