分子标记辅助选择抗南方玉米锈病材料

谭 华，邹成林，郑德波，韦新兴，黄爱花，蒋维萍，韦 慧，黄开健（广西农业科学院玉米研究所，广西 南宁 530007）

分子标记辅助选择抗南方玉米锈病材料

谭 华，邹成林，郑德波，韦新兴，黄爱花，蒋维萍，韦 慧，黄开健
（广西农业科学院玉米研究所，广西 南宁 530007）

以来自国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）的高抗南方玉米锈病种质为抗锈源，把抗病基因导入来自温带欠抗锈种质，借助分子标记辅助选择，聚合抗锈基因定向改良，对获得的BC2F2进行田间抗病性接种鉴定。结果显示，利用phi048选择与抗病亲本相同带型的BC2F2家系368个单株接种鉴定，抗及高抗级别植株共235株，占总株数的63.9%；中抗级别植株114株，占31.0%；感病植株19株，占5.1%。表明利用phi048对南方玉米锈病抗病材料进行早代选择是有效的，可淘汰大量感病家系，减轻田间工作量；利用分子标记辅助定向选择结合抗病接种鉴定，能有效改良温带种质的抗锈性。

南方玉米锈病；分子标记辅助选择；抗锈改良

谭华，邹成林，郑德波，等 . 分子标记辅助选择抗南方玉米锈病材料［J］.广东农业科学，2016，43（7）：6-10.

南方玉米锈病是由多堆柄锈菌引起的玉米产区流行性重要病害，对玉米生产危害日益严重［1-3］，其蔓延发展已成为制约玉米生产一大病害。发掘和利用南方锈病抗病基因资源、筛选和培育抗病品种是控制南方玉米锈病的有效途径［4-6］，前人研究发现来自热带、亚热带玉米种质比温带种质具有更丰富遗传多样性，是寻找玉米抗锈基因的重要种质资源［7］，国际玉米小麦改良中心（CIMMITY）种质中蕴涵着丰富的抗锈基因，将其导入温带种质和选择抗锈基因，可有效提高温带种质的抗锈性，在抗病育种中拓宽丰富玉米育种种质遗传基础［8-9］。李少博等［3］以齐319为抗源改良京24南方玉米锈病的抗性，通过分子标记辅助前景选择和背景选择，实现京24在抗锈性状上的定向改良；蒋雅娟等［10］将P25携带的抗病基因通过回交途径转移到感病自交系F349上，连续回交所得BC5代的F349抗病近等基因系，田间抗感结果与分子检测结果一致，选择效率达97.9%。本研究拟通过利用回交转导，以温带欠抗锈种质为受体导入抗锈基因，借助分子标记辅助前景选择，结合田间接种鉴定，对温带种质聚合抗锈性定向改良，探讨导入抗锈基因改良温带种质的抗锈性，为抗病育种提供新的抗锈基因源途径。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试材料以来自CIMMYT的CML161、CML166、CML170、CML190为供体，以温带感南方玉米锈病种质Q205、黄C、CAI60、L2548、丹340、掖478等玉米自交系为受体，借助农艺性状选择与分子标记相结合进行回交世代选择，经1次杂交2次回交1次自交获得的BC2F2分离群体，以双M9为高抗对照，以黄早四为高感对照。

1.2试验方法

SSR分子标记：玉米苗期5-6叶取幼嫩叶片采用CTAB法提取DNA；SSR标记phi048序列来自 Maize GDB（2002），由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。重复序列为（GCC）n：

phi048-F：5' -GCAAACCTTGCATGAACCC GATTGT-3'

phi048-R：5' - CAAGCGTCCAGCTCGAT GATTTC -3'

反应体系：反应总体积10 μL，包括ddH2O 6.6 μL，10×Buffer（含Mg2+）1.0 μL，dNTP （2.5mM）0.15 μL，Taq酶 0.1 μL，Primer（0.2 μmol/L）0.15 μL，DNA 2 μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，60℃复性45 s，72℃延伸 1 min，32个循环；再72℃延伸10 min；聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。

1.3田间锈病接种鉴定

试验在国家玉米改良中心南宁分中心明阳试验基地（22°12′N，107°19′E，海拔105 m）进行，单行区行长5.0 m，行距 0.7 m，每行留苗25株。采集提前种植的感染南方玉米锈病植株叶片，于水中揉搓纱布过滤得孢子悬浮液，于8～9叶期对CML161、CML166、CML170、CML190、Q205、黄C、CAI60、L2548、丹340、掖478等供试玉米材料采用喷雾接种，于傍晚喷雾植株叶片7～8 mL/株，喷后保持湿润环境，玉米乳熟至蜡熟期调查鉴定，重点调查玉米植株穗上叶和穗位下方3片叶，田间锈病调查分级标准［4］：1级为高抗（HR），叶片上无或极少孢子堆；3级为抗病（R），叶片上有少量孢子堆，占叶面积少于25%；5级为中抗（MR），叶片上孢子堆占叶面积26%～50%；7级为感病（S），叶片上有大量孢子堆，占叶面积51%～75%；9级为高感（HS），叶片上有大量孢子堆，大于叶面积75%。

2　结果与分析

2.1供试材料抗病性接种鉴定

各材料对南方玉米锈病的抗性调查结果（表1）显示，高感对照黄早四全株叶片上有大量锈病孢子堆，发病程度达9级；高抗对照双M9叶片上极少孢子堆，发病程度为1级，表明接种试验达到预期要求。CML161、CML166、CML170、CML190发病程度为1级，达高抗水平；Q205、黄C、CAI60、L2548、丹340、掖478叶片上有大量孢子堆甚至整株枯死，达7～9级感或高感水平。

接种鉴定试验结果表明，高抗对照双M9和高感对照黄早四达到预期的抗性表达，选用来自CIMMYT作为抗锈供体的CML161等4份材料具有抗锈能力强，达到高抗水平；来自温带材料Q205等6份作为受体材料在南方高温多雨生态条件感锈严重，叶片上有大量孢子堆甚至整株枯死，达感病或高感级别。

表1 供试玉米自交系对南方锈病的接种鉴定结果

2.2前景选择引物在抗感亲本间的筛选

参考前人对南方玉米锈病抗病基因的研究结果［11-12］，通过对前景选择phio41、phi118、phi097、bnlg176、phi402、umcl402、phi090、phi053、umcl528、phi074、phi019、phi048、phi077、phi123、phi114、phi015、phi044、phi016、phi059、phi050、phi062、phi092、phi076 等23 对候选引物进行PCR 扩增SSR选择，筛选获得在高抗对照和高感对照以及试验所用抗、感材料具有较好多态性的phi048进行选择，抗、感材料间能扩增出差异性条带。电泳结果（图1）显示，4个供体1、2、3、4带型与高抗对照双M9（CK1，呈上带）带型一致，6个受体材料带型与高感对照黄早四（CK2，呈下带）带型一致，表明可选取phi048引物用于回交群体进行基因型单株标记区分选择。

图1 引物 phi048 检测4 个供体和6个受体玉米自交系多态性

2.3分子标记前景选择与田间鉴定结果比较

种植利用分子标记与高抗对照双M9带型一致的BC2F2代分离群体进行南方型锈病抗性接种鉴定，共鉴定368株。不同群体抗性接种鉴定结果（表2）表明，达到高抗及抗水平235株，占鉴定总株数的67.4%～60.9%；中抗（5级）植株114株，占总株数的37.0%～21.7%；感病植株19株、占5.1%。

表2 BC2F2代分离群体接种鉴定结果

南方型锈病抗性鉴定结果表明与高抗对照双M9带型一致的BC2F2代分离群体中，达到高抗及抗水平的植株占63.9%，中抗级别占31.0%，二者接近植株总数的95%，感病植株19株、占5.1%，表明所用引物进行分子标记辅助目标性状选择，有较高选择准确性，可淘汰与高感对照带型一致的材料，减轻田间工作量。

3　结论与讨论

我国玉米品种和自交系大多易感染南方玉米锈病，己定位的抗锈病基因为单显性基因，相对单一的抗性遗传背景不利于抗性的持久利用，应寻找不同遗传背景的抗锈源，以抗病育种手段控制南方锈病［8-9，13］；防治南方锈病安全、经济、有效的方法是培育抗病品种，而创制抗病种质是开展抗病育种的重要基础［14］。本试验结果表明，不同自交系对南方型锈病抗、感差异显著，其中来自CIMMYT的种质具有抗锈能力强，可作为抗锈供体改良温带种质；来自温带背景的种质在南方低纬高温多雨条件易感南方玉米锈病，不同自交系的抗感程度不同，表现的感病症状也不同，来自温带的玉米在南方高温多雨生态条件大多感锈严重，叶片上有大量孢子堆甚至整株枯死。

本研究以4份高抗南方玉米锈病为供体，6份感锈自交系为受体通过杂交、回交聚合抗锈基因，对利用分子标记选择的BC2F2代分离群体进行南方型锈病抗性鉴定，统计发现与高抗对照双M9带型一致的368株BC2F2代分离群体达到高抗及抗水平植株235株、占63.9%，中抗级别114株、占31.0%，二者接近植株总数的95%，感病植株19株、占5.1%，可以认为所用引物进行分子标记辅助目标性状选择，可提高选择的准确性。

分子标记辅助选择目标性状在其他作物上的应用已有诸多报道，潘晓飚等［15］利用分子标记辅助选择和田间鉴定选择相结合通过基因聚合，获得带有抗稻瘟病兼抗白叶枯病的双基因或多基因聚合材料；曾祥艳等［16］通过复合杂交、回交，利用抗病性鉴定和分子标记辅助选择，选育出聚合了多个抗病基因的兼抗白粉、条锈和黄矮病的小麦新种质；李文凤等［17］以5个己知含抗褐锈病基因Brul和5个高感褐锈病的甘蔗品种为试材，成功构建了甘蔗抗褐锈病基因Brul的分子快速检测体系；此外，在甜瓜、辣椒上利用分子标记辅助聚合抗性基因，对甜瓜抗蔓枯病在BC3F3世代即获得蔓枯病抗性显著提高且果实性状良好的改良材料及辣椒抗疫病新种质［5，19］。

本研究通过对BC2F2代分离群体田间接种鉴定与室内检测结果进行比较，表明本试验筛选获得的标记对抗锈群体进行辅助选择是有效的，不同群体标记结果有所差异。有学者认为不同组合分离群体的标记结果有显著差异，在于可能与基因的遗传背景有关［21］。本试验结果表明，所筛选的前景引物对南方锈病的分子辅助选择是可行的，标记选择和田间接种表型鉴定相结合，选择抗南方玉米锈病材料是有效的，在抗病育种中，对南方玉米锈病抗病能力的转移，可以通过杂交回交转导借助分子标记辅助选择，提高选择的准确性和效率，达到预期育种目标和拓宽玉米育种种质的遗传基础。

［1］ 穆春华，鲁守平，付晋，等. 玉米南方锈病的研究进展［J］. 福建农业学报，2013，28（5）：509-512 .

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［15］ 潘晓飚，陈凯，张强，等. 分子标记辅助选育水稻抗白叶枯病和稻瘟病多基因聚合恢复系［J］. 作物学报，2013，39（9）：1582-1593.

［16］ 曾祥艳，张增艳，杜丽璞，等. 分子标记辅助选育兼抗白粉病、条锈病、黄矮病小麦新种质［J］. 中国农业科学，2005，38（12）：2380-2386.

［17］ 李文凤，王晓燕，黄应昆，等. 甘蔗抗褐锈病基因Brul分子检测体系的建立与应用［J］. 植物保护，2015，41（2）：120-124.

［18］ 毕研飞，徐兵划，郭静，等. 分子标记辅助甜瓜抗蔓枯病基因聚合及‘白皮脆’品种改良［J］.南京农业大学学报，2015，38（3）：375-380.

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（责任编辑 邹移光）

Selection of materials with resistance to southern corn rust（SCR） by marker-assistant selection（MAS） in maize （Zea mays L.）

TAN Hua，ZOU Cheng-lin，ZHENG De-bo，WEI Xin-xing，HUANG Ai-hua，
JIANG Wei-ping，WEI Hui，HUANG Kai-jian
（Maize Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China）

In order to improve the maize resistance to southern corn rust of temperate germplasm，the resistant genes，which came from germplasm of high SCR-resistant in CIMMYT，were introduced in temperate germplasm. The SCR-resistance of temperate germplasm was directionaly improved by pyramiding SCR-resistant genes. 368 plants of a BC2F2 family，which had the same polymorphism with the SCR-resistant parent by detecting with SSR marker phi048，were used to identify their SCR-resistance by artificial inoculation in field. The results showed that 235 plants were highly resistant or resistant，accounting for 63.9%，114 plants were moderately resistant，accounting for 31.0%，19 plants were susceptible，accounting for 5.1%. The results demonstrated that SSR marker phi048 was effective to select SCR-resistant materials in early stage，which could knock out lots of SCR-susceptible lines therefore reduce plenty of field work. The SCR-resistance of temperate germplasm was effectively improved by directional selection with marker assistant combined to identification with artificial inoculation.

southern corn rust （SCR）；marker-assistant selection （MAS）；SCR-resistant improvement

S513.034

A

1004-874X（2016）07-0006-05

2015-09-17

广西重大科技计划专项（桂科重14121001-1-9）；广西自然科学基金（2013GXNSFAA019101）

谭华（1959-），男，研究员，E-mail：TH19881206@163.com