9种市售阿胶蛋白质特性比较分析



9种市售阿胶蛋白质特性比较分析

CHANG Bing-yu1CHENMao-shen1HAOXiang-hui2,3GUOShang-wei2,3MAJian-guo1ZHONGFang1

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.Dong’eE-jiaoCo.,LTD,Liaocheng,Shandong252201,China;3.NationalEngineeringResearchCenterforGelatineTCM,Liaocheng,Shandong252201,China)

对9种市售阿胶(E1～E9)进行蛋白质特性分析比较，包括氨基酸组成、等电点、二级结构和分子量分布。结果表明，9种市售阿胶的蛋白质等电点均在4.38～4.88，无明显差异；圆二色谱表明所有样品中蛋白质的三螺旋结构均被破坏，呈无规则卷曲状态；氨基酸组成大致相似，而亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)组成有一定差异，E2、E3、E4、E9的亚氨基酸含量较低，小于23.8%，其余5种样品的含量较高，大于25.0%；蛋白质分子量分布有较大差异，E2、E4、E7、E8的阿胶蛋白质分布更分散，含有较多的高分子蛋白(占比>4.46%)，且主要蛋白质的重均分子量较大，为120～132 kD，而其余5种样品的分子量分布较集中，高分子蛋白占比小于1.16%，且主要蛋白质的重均分子量较小，为36～42 kD。市售阿胶的蛋白质差异主要是蛋白质的降解程度不同造成的。阿胶差异化评价的蛋白质特性评价，为进一步考察工艺对蛋白质特性的影响提供依据。

阿胶；氨基酸；分子量分布；蛋白质特性

阿胶(Asini Corri Collas，ACC)与人参、鹿茸并称“中药三宝”，是中国传统名贵中药，有滋阴补血、润燥止血的功效[1]。针对阿胶的药理作用机制，研究人员作了很多研究。通过分析阿胶的主要成分发现其中含有丰富的氨基酸和微量元素[2]，为人体提供必要的营养物质；还有研究发现阿胶中含有较多的羧基、硫酸酯基、硫酸基等负电荷，可形成聚负离子基结构，电泳时偏向阳极[3]，每个分子可形成一个稳定的大分子晶体结构，使其不必进入细胞内部，仅通过细胞外间质的代谢来调节细胞功能，参与生理与病理过程[4]。

阿胶的主要成分有蛋白质、氨基酸及微量元素，还有硫酸皮肤素等多糖类物质。其中，蛋白质类含量约为60%～85%，是阿胶的主要成分[5]。多肽和氨基酸主要是在制胶过程中胶原蛋白部分肽键断裂所形成的一系列降解产物[6]。阿胶补血补益作用的物质基础与阿胶中蛋白质类物质有密切关系，研究阿胶中蛋白质、多肽的特性和结构尤为重要。如今，对阿胶蛋白质的特性已有一定的研究，李峰等[7]对阿胶和其它动物胶进行了SDS-PAGE分析，得出了阿胶蛋白质各电泳谱带的泳动率Rf值；陈振江等[8]采用IFE法测定出阿胶及其伪品中几种主要蛋白质的等电点在4.15～4.80。这些研究多侧重于真伪鉴别和阿胶与其它动物胶的对比，没有对阿胶蛋白质的特性进行系统的研究，同时，尚未有对市售阿胶中蛋白质特性差异进行研究。

本研究从市场上收集了具有代表性的9种阿胶样品，拟对其蛋白质特性如氨基酸组成、等电点、二级结构和分子量分布进行详细的分析对比，从而揭示不同厂家所产阿胶的内在差别所在，对生产优质阿胶有一定的指导意义，补充完善现有的阿胶评价中蛋白质特性评价部分，并为下一步研究加工工艺对蛋白质特性的影响提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

样品E1～E9：9种市售某品牌阿胶；

牛血清白蛋白、叠氮化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂均为分析纯；

高效液相色谱仪：Agilent1260型，美国安捷伦公司；

多角度激光散射凝胶色谱仪：DAWN HELEOS Ⅱ型，美国怀雅特技术公司；

圆二色光谱仪：MOS-450型，法国Biologic公司；

Zeta电位及纳米粒度分析仪：ZetaPALS型，美国布鲁克海文仪器公司；

电子天平：AL204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司。

1.2成分测定

(1) 水分含量：直接干燥法[9]。

(2) 蛋白质含量：凯氏定氮法[10]。

1.3阿胶蛋白质的提纯

称取适量阿胶于热水中充分溶解，4 000 r/min离心10 min，加入预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为75%，4 ℃保存1 h后，于4 ℃，5 000 r/min条件下冷冻离心15 min。去上清液，加入25 mL预冷的75%乙醇，4 ℃保存30 min，冷冻离心，去上清液，反复洗涤3次。沉淀物于通风橱挥尽酒精味后，水洗至培养皿中，冷冻干燥得蛋白提纯物[11]。提纯后的阿胶蛋白中，蛋白含量均大于94%，糖含量均小于0.82%。该方法的蛋白提取率高于85.31%，糖去除率高于91.20%，提取出的蛋白可以代表阿胶中的主要蛋白。

1.4阿胶蛋白的氨基酸组成分析

精密称取提纯物放入水解管中，加入8 mL盐酸溶液(6 mol/L)和2滴辛醇，将水解管抽真空密封，于110 ℃烘箱中水解21 h。取出冷却后定容至25 mL，过滤。吸取1 mL滤液放入烧杯中，置于含有氢氧化钠的干燥器中50 ℃保温过夜。加入1 mL盐酸溶液(0.02 mol/L)，混匀，离心，将上清液转移至样品瓶中待测[12]。

采用OPA-PMOC柱前衍生化分析方法。色谱条件：色谱柱250 mm×4.6 mm，5 μm；柱温：40 ℃；流动相：A相，称取8.0 g结晶乙酸钠于1 000 mL烧杯中，加入1 000 mL开水搅拌至所有结晶溶解，再加225 μL三乙胺，搅拌并加5%的醋酸，调pH 7.2，加入5 mL四氢呋喃，混合后备用；B相，称取8.0 g 结晶乙酸钠于800 mL烧杯中，加入400 mL开水搅拌至所有结晶溶解，滴加2%的醋酸，pH调至7.2，将此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇备用；流速：1.0 mL/min；紫外检测器：262 nm(脯氨酸和羟脯氨酸)，338 nm(其余氨基酸)；梯度洗脱[13]。

1.5阿胶蛋白的等电点分析

阿胶蛋白质等电点的测定根据Nalinanon等[14]的方法修改如下：称取提纯物加水溶解后配制成0.4 mg/mL溶液，用0.02 mol/L的NaOH和HCl调节pH，每隔0.5个pH取样，测定其Zeta电位。

1.6阿胶蛋白的二级结构分析

采用圆二色光谱仪对样品进行圆二色谱分析。称取提纯物加水溶解后配制成1 mg/mL的溶液，4 000 r/min离心5 min，取上清液供试。样品吸收池光程为0.01 cm，谱带宽度：1 nm；测定范围：180～300 nm；扫描波长间隔：0.1 nm；每点响应时间：1 s；每个供试品重复测定3次；测定温度：室温。

1.7阿胶蛋白的分子量分析

采用多角度激光光散射凝胶色谱系统(HPSEC-RI-MALLS)测定阿胶蛋白质分子量分布。流动相采用含0.15 mol/L 氯化钠的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0,含0.02%叠氮化钠)；流速为0.35 mL/min，紫外检测器波长选用220 nm。用牛血清白蛋白(Mw=77 kDa)校准仪器。

称取适量提纯物粉溶解于流动相，配制成1 mg/mL的样品溶液，过0.45 μm微孔滤膜后进行HPSEC-RI-MALLS分析。采用ASTRA软件进行数据处理。dn/dc值取0.185[15]。

1.8数据分析

使用SPSS 19.0和Origin 8.5软件进行数据分析，显著性分析采用最小显著差法(LSD)检验，P≤0.05认为差异显著。

2　结果与分析

2.1阿胶蛋白质含量分析对比

阿胶的蛋白质含量可由氮含量乘以换算系数而计算出，驴皮的换算系数取5.55。市售阿胶的蛋白质含量见表1。9种阿胶的蛋白质含量在72.15%～89.44%，含量很高，与赵曦等[16]的研究结果类似。

2.2阿胶蛋白的氨基酸组成分析

对提取后的阿胶蛋白质的氨基酸组成进行分析，结果见表2。共检测出阿胶蛋白质中含有17种氨基酸，含7种必需氨基酸。阿胶属于胶原蛋白水解产物，不含色氨酸、半胱氨酸。所有样品中，以甘氨酸含量最高，占总氨基酸含量的21.5%～22.5%，其次为谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丙氨酸和精氨酸，以上6种氨基酸为阿胶中主要氨基酸，占氨基酸总量的70%以上，与已有的报道[17]一致。分析对比9种阿胶蛋白质的氨基酸组成差异，可以发现大多数阿胶蛋白质的组成非常接近，但亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)的组成有一定的差异。据报道[18]，亚氨基酸是胶原蛋白中起到稳定三螺旋结构的重要氨基酸，而降解程度过大会导致亚氨基酸较多地释放。因此，亚氨基酸含量较低的样品可能与驴皮中胶原蛋白的降解程度有关。

表1　不同阿胶蛋白质含量

表2　不同阿胶氨基酸组成†

†每1 000个氨基酸残基含有的氨基酸残基数；亚氨基酸为脯氨酸和羟脯氨酸之和。

2.3阿胶蛋白的等电点分析

Zeta电位是描述胶粒表面电荷性质的一个物理量，它是距离胶粒表面一定距离处的电位。若胶粒表面带有某种电荷，其表面就会吸附相反符号的电荷，构成双电层[19]。在滑动面处产生的动电电位叫做Zeta电位。在溶液pH<等电点(pI)时，由于可电离氨基酸的增加，胶粒表现为带正电荷；

图1　阿胶蛋白溶液(E9)在不同pH下的Zeta电位

pH>pI时，胶粒表面所带电荷为负；当pH=pI时，胶粒表面上的正电荷数与固定层吸附的负离子数相等，Zeta电位为零，可以求得此时溶液的pH值，即为溶液的pI。

阿胶蛋白溶液在不同pH下的Zeta电位曲线见图1(以E9为例)，可以求得其Zeta电位为零时的pI值。各样品的等电点值见表3。

表3　不同阿胶蛋白溶液的等电点

结果表明，所有样品的pI在4.38～4.88。由于胶原蛋白的pI在4.8左右，水解的进行使酰胺键断裂，羧基释放，从而使阿胶的pI略微下降[20]。但是由于阿胶的制作工艺均是胶原蛋白的热裂解，因此所有样品的pI相差很小，仅相差0.5，与安广杰等[21]的研究结果类似。

2.4阿胶蛋白的二级结构分析

圆二色谱(CD)通常被用来研究蛋白分子的空间构象。一般分为远紫外区(190～250 nm)与近紫外区(250～500 nm)，远紫外区反映的是主链构象，属于肽键的吸收，常被用来表征蛋白的二级结构信息；而近紫外区则主要反映蛋白的三级结构信息[22]。

阿胶蛋白质的远紫外区圆二色谱图见图2(以E1为例)，其余样品的圆二色谱图与E1相似，均在190 nm左右有一大的负峰，在220 nm左右处几乎无峰或仅有微弱的小峰。天然胶原蛋白具有三螺旋结构，其圆二色谱特征是在190～200 nm左右有一个强的负吸收峰，在210～230 nm时有一个弱的正吸收峰。而所有阿胶蛋白样品的圆二色谱图在220 nm左右处几乎无峰或仅有微弱的小峰。阿胶中蛋白质经过工艺中的化皮、熬煮处理，其三螺旋结构已被破坏或仅有极少量的三螺旋结构，表明市售阿胶中的蛋白质构象无差异，均呈现无规则卷曲的状态。

2.5阿胶蛋白的分子量分布

各个样品的分子量分布见图3。由图3可知，各个样品的分子量分布曲线有较大差异，为方便对比样品，将洗脱曲线分为三部分，分别为20～25 min高分子量区域，25～32 min中分子量区域和32～37 min低分子量区域，并用ASTRA软件计算出各区域的重均分子量和所占比例，见表4。由图3中各样品的流出曲线可知，阿胶中的蛋白质分子量为连续分布，集中在中分子量区域(占比为82.37%～98.02%)，各样品的重均分子量为37～132 kDa。各样品的蛋白质重均分子量和分子量分布有较大差异。

图2　阿胶蛋白质(E1)的圆二色谱图

样品名高分子量区域Mw/kD占比/%中分子量区域Mw/kD占比/%低分子量区域Mw/kD占比/%E121370.824296.08363.10E247055.1412882.376112.50E339420.253891.42468.32E442607.4513287.01895.54E532991.163787.502211.34E647720.493694.16295.35E730704.4612085.153310.39E841695.5613090.851733.59E978150.163698.02331.82

图3　不同阿胶蛋白质分子量分布

由表4可以得出，各样品的中分子量区域的重均分子量有较大差异，其中，E2、E4、E7、E8的重均分子量较大(为120～132 kDa)，其余样品的重均分子量较小(为37～42 kDa)。

由图3可以看出，各样品的分子量分布有较大差异。可以将所有样品分为4类，第一类为E1、E9，仅中分子量区域有一个较窄的大峰，表明这类样品的蛋白质分子量分布很集中，集中在中分子量区域，占比达96%以上；第二类为E3、E5、E6，这类样品的分子量分布曲线除了有一个中分子量区域的较窄大峰外，在低分子量区域还有一个小峰，其蛋白质在高分子量区域分布很少，在低分子量区域的分布较多(占比为5.35%～11.34%)；第三类为E8，分子量分布曲线为一个较宽的大峰，呈现出明显的前沿峰，分子量分布较分散，蛋白质在高分子量区域有分布(占比为5.56%)；第四类为E2、E4、E7，这类样品的分子量分布曲线除了有一个较宽的大峰之外，在小分子量区域还有一个小峰，分子量分布较分散，这类样品在高分子量区域有少量分布(占比为4.46%～7.45%)，在低分子区域也有分布(占比为5.54%～12.50%)。

阿胶生产过程是胶原降解的过程，降解条件的强弱和时间长短直接影响了阿胶分子量分布[23]。降解不充分可能导致高分子量蛋白的残留，而降解程度过大可能导致产生较多的低分子量蛋白。第二类样品在大峰之后又出现一个小峰，存在少部分低分子量蛋白质，可能是降解程度较大导致的，第三类样品呈现出前沿峰，存在大分子量蛋白质，可能是降解程度小导致的。第四类样品有前沿峰，且在大峰后出现一个小峰，表明同时存在大分子量和低分子量蛋白，则可能是降解条件较为剧烈，产生了较多的低分子量蛋白，但作用时间又较短，使得大分子量蛋白质有一定的残留。第一类样品的分子量分布集中，可能与其降解条件适中有关。合适的降解程度是生产高质量阿胶的重要保证，降解驴皮的程度和条件是未来阿胶研究的重要方向。

3　结论

对市售的9种阿胶进行蛋白质特性分析。通过测定Zeta电位计算出阿胶蛋白的等电点，发现9种市售阿胶的蛋白质等电点无明显差异。圆二色谱图显示9种阿胶蛋白的二级结构均呈现无规则卷曲状态，在加工过程中蛋白质的三螺旋结构被破坏。氨基酸结果显示，共检测到17种氨基酸，其中15种氨基酸组成接近，而亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)的组成上有一定的差异，这与加工过程中的过度降解有关。HPSEC-RI-MALLS结果表明，蛋白质分子量大小和分子量分布有较大差异，有4种阿胶的蛋白质分布较为分散，呈现出明显的前沿峰，存在较多的高分子蛋白质，可能与降解不充分有关。因此，市售阿胶的蛋白质差异主要是驴皮中蛋白质降解程度的不同造成的。本研究补充完善了现有的阿胶差异化鉴别的蛋白质特性部分，可为进一步考察工艺条件对蛋白质降解程度的影响提供依据。

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Comparison and analysis of the protein characteristics in 9 kinds of commercial Asini Corii Collas

常冰玉1陈茂深1郝向慧2,3郭尚伟2,3麻建国1钟芳1

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡214122；2. 东阿阿胶股份有限公司，山东 聊城252201；3. 国家胶类中药工程技术研究中心，山东 聊城252201)

The protein characteristics of 9 kinds of commercial Asini Corri Collas (ACC, E1—E9) were compared, including amino acid composition, pI, secondary structure and molecular weight distribution. The differences of pI were negligible and all samples showed a range of 4.38—4.88. Circular dichroism results indicated that only random coil configurations was observed of all ACC samples due to the damage of triple helix structures. The amino acid composition was similar other than some differences in imino acid (Pro and Hyp) composition. E2, E3, E4 and E9 showed lower imino acid content (<23.80%) than that of others (>25.0%). Significant differences in the molecular weight distribution were observed. E2, E4, E7 and E8 appeared to be in a wider distribution containing more high molecular weight (>4.46%) and the major MW fraction was located in the range of 120-132 kD. The other 5 samples, however, showed a narrower distribution (high molecular weight protein <1.16%) and the major MW fraction was located in the range of 36-42 kD. The difference in protein characteristics of commercial ACC attributed to the differences in degradation degree of protein. This study would improve the protein characteristics evaluation system of ACC and lay a foundation to further study the effect of processing on protein characteristics.

Asini Corri Collas; amino acid; molecular weight distribution; protein characteristics

常冰玉，女，江南大学在读硕士研究生。

钟芳(1972—)，女，江南大学教授，博士生导师。

E-mail：fzhong@jiangnan.edu.cn

2016-03-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.049