2015年云南省西双版纳州登革2型病毒暴发疫情的调查研究

李园园　冯云　范建华　李鸿斌　朱进　潘虹　李卫平　高阳　张海林

666100 景洪，西双版纳州疾病预防控制中心(李园园、范建华、李鸿斌、朱进、李卫平、高阳)；671000 大理，云南省地方病防治所云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室(冯云、潘虹、张海林)



·论著·

2015年云南省西双版纳州登革2型病毒暴发疫情的调查研究

李园园冯云范建华李鸿斌朱进潘虹李卫平高阳张海林

666100 景洪，西双版纳州疾病预防控制中心(李园园、范建华、李鸿斌、朱进、李卫平、高阳)；671000 大理，云南省地方病防治所云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室(冯云、潘虹、张海林)

李园园、冯云为共同第一作者

目的阐明2015年云南省西双版纳州登革热流行病学特征和登革病毒血清型及其传播来源。方法收集登革热病例资料，采集患者急性期血清标本，用RT-PCR法检测登革病毒核酸，并进行登革病毒C/PrM区核苷酸序列测定和分析。 结果2015年西双版纳州共报告登革热病例1 132例，其中本地感染病例1 089例(96.20%)、输入性病例43例(3.80%，来自缅甸38例、老挝3例和泰国2例)。本地流行地区主要为景洪市城区和嘎洒镇，该流行区中埃及伊蚊为优势蚊种，流行月份为7-12月。病例年龄分布以20-49岁组为主，最小2岁，最大93岁；男女性别比为1∶1.05。经登革病毒核酸检测和序列测定，从患者血清中获得33株病毒的C/PrM区基因核苷酸序列。进化分析表明，这33株病毒均为登革2型病毒，其中的泰国输入性病例分离株与本地流行株高度同源，同为一个进化群，并与东南亚和我国福建和广东流行株亲缘关系较近，但与云南省瑞丽市2014年登革2型病毒流行株亲缘关系较远。 结论2015年西双版纳州发生了由登革2型病毒引起的本地登革热流行，来自泰国的登革热输入性病例是引起本地登革热流行的主要原因，埃及伊蚊是主要传播媒介。加强输入性病例和本地病例的监测和管理以及蚊虫控制是防止本病蔓延扩散的关键措施。

【主题词】登革热；登革热病毒；进化分析；流行病学

登革热(denguefever,DF)是由登革病毒(denguevirus,DENV)引起的急性传染病，DENV分为4个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，广泛流行于全球热带和亚热带地区，以东南亚地区流行较为严重[1-3]，埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)是主要传播媒介。我国DF主要分布在东南部地区[4-7]。2000-2012年云南省报告的DF主要是输入性病例[8-10]，2013年云南省西双版纳州景洪市和德宏州瑞丽市首次暴发本地DF疫情[11, 12]，2014年瑞丽市再次发生本地DF流行[13]。2015年西双版纳州再次暴发DF，为阐明本次疫情的流行特征和DENV血清型，我们进行了流行病学调查以及DENV序列测定和分析。

1　材料与方法

1.1病例登革热病例资料来源于2015年西双版纳州传染病报告信息管理系统以及登革热病例个案调查表和流行病学调查资料。根据中华人民共和国卫生行业标准-登革热诊断标准(WS216—2008)和中华人民共和国卫生和计划生育委员会印发的《登革热诊疗指南》(2014年第2版)对病例进行诊断并确定病例性质(输入性病例和本地病例)。所有DF病例均为实验室诊断病例。用Excel2007版软件对病例数据进行统计分析，采用描述流行病学方法进行流行特征分析。

1.2实验室诊断对患者急性期血清标本进行DENV-NS1抗原检测，试剂为登革热NS1快速测试卡(免疫层析法)(美国Cortez诊断股份有限公司，批号：TK1112)。根据《登革热诊疗指南》，如在急性期血清中检测到DENV-NS1抗原，表明该患者感染了DENV，可确定为登革热实验室诊断病例。

1.3DENVRT-PCR试验用QIAampViralRNAMiniKit(德国Qiagen公司)提取患者血清中的病毒RNA，用AmershamBioscienceReady-To-GoTMYouPrimeFirst-StrandBeads(美国AmershamPharmaciaBiotech公司)制备cDNA。取2μlcDNA做反应模板，以D1和D2为引物[3]，PCR扩增C/PreM区段基因(511bp)。反应条件为94 ℃预变性2min；94 ℃ 30s、55 ℃ 30s、68 ℃ 30s，扩增9个循环后；94 ℃ 30s、55 ℃ 30s、68 ℃ 30s(每个循环增加10s)，扩增25个循环；68 ℃延伸10min。反应结束后，取2μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.4序列测定和分析所有PCR扩增产物的测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。采用ClastalX1.83进行核苷酸序列比对，采用MEGA5软件邻接法(Neighbor-joining)进行DENV基因核苷酸序列系统发生树分析。引用GenBank中来自不同国家和地区、不同年代的36株DENVC/PreM区段核苷酸序列，其中1型6株、2型21株、3型5株、4型4株，外群为流行性乙型脑炎病毒(JEV-P3/JEU47032)。

1.5媒介伊蚊调查2015年5-9月在西双版纳州设15个伊蚊幼虫固定监测点，其中景洪、勐腊和勐海县各5个监测点，按照云南省登革热媒介监测方案开展布雷图指数(BI)监测，并对阳性点捕获的伊蚊幼虫，经羽化为成蚊后进行种类鉴定，确定埃及伊蚊和白纹伊蚊。

2　结果

2.1流行概况西双版纳州于2015年7月13日报告当年首例DF输入性病例，12月5日报告末例DF输入性病例；8月20日报告当年首例DF本地感染病例，12月1日报告末例DF本地感染病例，本地流行持续114d。共报告DF1 132例，无死亡病例；其中，本地感染1 089例(96.20%)(景洪市1 046例、勐海县23例、勐腊县20例)，他们的感染地几乎均为景洪市城区和嘎洒镇；输入性病例43例(3.80%，来自缅甸38例、老挝3例、泰国2例)，景洪市8例、勐海县33例、勐腊县2例。

2.2流行特征

2.2.1地区分布：西双版纳州所辖3县、市均有DF病例报告，其中，病例数最多的是景洪市，共1 054例(93.11%)；其次为勐海县56例(4.95%)和勐腊县22例(1.94%);上述3县发病率依次为200.31/10万、16.37/10万和7.66/10万。景洪市疫情波及13个乡镇、农场，其中以景洪城区(允景洪街道办事处)报告的病例最多(979例，92.88%)，疫点遍及主城区；其次为与允景洪镇相邻的嘎洒镇(44例，4.17%)，其余乡镇、农场发病数较少。勐海县有8个乡镇有病例报告，勐腊县5个乡镇有病例报告，均以县城城区为主。

2.2.2时间分布：流行期为7-12月，其中9月(173例)、10月(658例)和11月(285例)发病数较多，共1 116例，占总病例数的98.59%；7月(2例输入)、8月(8例，其中本地7例和输入1例)和12月(6例，本地和输入各3例)病例较少，1-6月无病例。7月仅有输入性病例，8-12月输入性病例和本地病例均有报告。景洪、勐海和勐腊县流行期依次为7-12月、9-12月和10-12月。

2.2.3性别与年龄分布：在1 132例病例中，男性551例(48.67%)、女性581例(51.33%)，男女之比为1:1.05，女性稍多于男性；各年龄组均有发病，最小为2岁、最大93岁，主要集中在20-49岁，共827例，占73.06%，以青壮年发病为主。

2.2.4职业分布：各职业人群均有发病，发病数居前五位的职业为商业服务人员(194例，17.14%)、个体户(183例，16.17%)、家务待业(165例，14.58%)、农民(136例，12.01%)和离退休人员(119例，10.51%)，共占发病总数的70.41%(797/1 132)。

2.3时效性分析1 132例DF病例中，本地感染和输入性病例从发病到诊断的时间间隔中位数分别为4.46d和4.38d，本地病例的间隔中位数略高于输入性病例。

2.4媒介伊蚊分布共开展57轮285个点次的BI监测，5-6月BI指数均较低，7-9月普遍升高，其中景洪城区和嘎洒镇最高，大多在20-80之间，部份监测点有时高达100-110；勐腊县城区BI多在10-35之间；勐海县城区BI均保持在较低水平(≤5)，但该县打洛镇BI可达20-45。在本地登革热流行区的景洪城区及嘎洒镇对28个阳性点的伊蚊幼虫进行羽化，共获得埃及伊蚊成蚊2 213只，占73.72%；白纹伊蚊成蚊789只，占26.28%，前者构成比明显高于后者。

2.5DENV核酸检测和序列测定采用RT-PCR试验，对2015年7-11月采自西双版纳州的64份患者血清标本进行DENV核酸检测，结果阳性33份并获得它们的DENV-C/PrM区基因核苷酸序列。这33例患者中，7月1例(输入首例)、8月3例(本地首例及早期本地病例)、9月21例、10月6例、11月2例。其他31份标本检测阴性可能与标本经多次运输及冻融以至RNA浓度低有关。

2.6进化分析用上述33株DENV-C/PrM区基因片段核苷酸序列与来自GenBank中不同国家和地区的26株不同血清型DENV代表株相应区段核苷酸序列构建系统进化树，西双版纳33株DENV聚集在相对独立的一个小分支，并与国内外DENV-2同在一个分支，亲缘关系较为接近，而与1、3和4型DENV亲缘关系较远(图1)，结果证实西双版纳33株DENV均为DENV-2。

BNDENV2015,代表2015年西双版纳州的33株登革病毒图1　西双版纳2015年33株登革病毒C/PrM区基因片段系统进化分析BNDENV2015 representing the 33 strains of DENV-2 isolated from Xishuangbanna in 2015Fig.1　Phylogenetic tree based on the C/PrM gene of 33 DENV strains isolated from Xishuangbanna in Yunnan province in 2015

为进一步掌握西双版纳DENV-2之间及其与国内外同型流行株间的进化关系，使用本次获得的33株DENV-2与2014年云南省瑞丽市5株DENV-2和来自GenBank的21株DENV-2构建系统进化树。图2显示，所有2015年西双版纳流行株同处一个次级进化支，还发现它们与东南亚和我国福建和广东流行株亲缘关系较近，但与瑞丽市2014年流行株亲缘关系较远，表明本次西双版纳流行的DENV-2与2014年瑞丽市流行的DENV-2不属于同一个病毒株系。同时还发现，西双版纳本地病例的DENV-2与来自泰国的输入性病例的DENV-2(BND1529，该患者7月15日发病)高度同源(图2)，提示2015年西双版纳本地DF流行与来自相邻泰国的DF输入性病例密切相关。

黑色三角形代表本研究分离的33株DENV-2；黑色圆形代表2014年瑞丽市5株DENV-2图2　西双版纳2015年33株DENV-2与2014年云南省德宏州瑞丽市5株DENV-2的C/PrM区基因系统进化分析 Black triangles representing the 33 strains of DENV-2 isolated in this study; Black circles representing the strains isolated from Ruili in 2014Fig.2　Phylogenetic tree based on the C/PrM genes of 33 DENV-2 strains isolated from Xishuangbanna in 2015 and the 5 DENV-2 strains isolated from Ruili city of Dehong in 2014

3　讨论

西双版纳州位于云南省西南部，与DF地方性流行区缅甸、老挝和泰国相邻，有4个国家级口岸以及多条边贸通道及众多的边民互市点，为我国连接东南亚地区的重要陆路通道。此外，西双版纳机场的航班和澜沧江港口航船均往返于老挝、缅甸和泰国。大量的出入境人员和交通工具的流动，DF可通过输入性病例传播到该地区并引起流行，如2013年西双版纳州景洪市DENV-3暴发[11]以及2013年和2014年瑞丽市DENV-1和DENV-2流行[12, 13]均由来自老挝和缅甸的输入性病例引起。本研究证实，2015年西双版纳DF疫情的病原为DENV-2，并发现从流行初期到末期患者中获得的所有DENV-2之间高度同源，但与2014年滇西边境瑞丽市同型流行株存在明显不同，表明两地疫情无相关性。流行病学调查表明，2015年西双版纳州DF疫情首先发生于景洪市，7月出现输入性病例，8月发生本地病例，9月病例数快速上升并持续到11月，12月显著下降；根据流行株进化分析，首例来自泰国的输入性病例(BND1529，7月15日)与早期2例本地感染病例(BND1523，8月17日；BND1521，8月19日)的病原(DENV-2)高度同源，并与9-11月本地流行株属同一进化群，亲缘关系最近。由此认为，2015年景洪市的本地DF流行与来自泰国的输入性病例密切相关。虽然勐海和勐腊县均有DF输入性病例，但勐腊来自老挝的2例病例的输入时间为10月，勐海来自缅甸的33例病例的输入时间为9-12月，流行病学分析认为，这些输入性病例与景洪市本地DF流行无相关性。

20世纪80和90年代的媒介调查显示，白纹伊蚊在西双版纳州广泛分布，并从该蚊中分离到登革3和4型病毒[14-16]，还从当地人群血清中检测到DENV抗体，表明20世纪后期，该地区曾发生过DF流行。近期调查亦表明，白纹伊蚊仍在西双版纳州广泛分布[17]。埃及伊蚊是DF最重要的传播媒介[2, 3]，云南省首次于2004年在瑞丽市姐告口岸发现埃及伊蚊[18]，随后，2009和2011年在西双版纳州的勐腊关累港和景洪港相继发现该蚊，2013年景洪市DF流行期间该蚊在该市城区的构成比明显高于白纹伊蚊，2014年在西双版纳3个县、市的13个乡镇发现该蚊并主要分布在城市地区[17]。本次调查进一步证实埃及伊蚊为景洪城区(允景洪镇)和嘎洒镇的优势蚊种，其分布区域与本地DF流行区相一致，提示该蚊种是本次疫情的主要传播媒介。

西双版纳州2013年和2015年DF本地流行均主要发生在景洪城区及其邻近地区，虽然这两起疫情的上升和下降以及高峰期存在明显差异，但疫情均始于7月，止于12月，与气温、降雨量和伊蚊密度密切相关。虽然这两起疫情均引起了当地政府的高度重视，采取了强有力的控制措施，但也暴露出对早期疫情控制的不足，如2015年早期病例仅局限在景洪市某住宅小区，由于该疫点未能及时消除，以至疫情逐渐扩散并波及整个城区及邻近地区。2013年的情况亦然。鉴于埃及伊蚊在该地区的快速扩散以及相邻东南亚国家DF病例输入的风险，今后应全面落实经常性的全民参与的蚊虫控制措施，并加强全年输入性和本地病例的监测，其中6月和7月应作为监测的重点时段；因蚊媒BI开始明显上升且输入性病例也开始出现，此期如能及时发现每一例DF病例尤其是境外入境人员中的病例，尽早采取有效的防蚊隔离和应急灭蚊措施，对防止因输入性病例引起的本地疫情至关重要；同样，对局部早期发生的本地疫情也可有效控制其传播扩散。

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Investigation on an outbreak of dengue serotype 2 virus in Xishuangbanna prefecture of Yunnan province in 2015

LiYuanyuan,FengYun,FanJianhua,LiHongbin,ZhuJin,PanHong,LiWeiping,GaoYang,ZhangHailin

XishuangbannaPrefectureCenterforDiseaseControlandPrevention,Jinghong666100,China(LiYY,FanJH,LiHB,ZhuJ,LiWP,GaoY);YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention,YunnanProvincialKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,Dali671000,China(FengY,PanH,ZhangHL)

LiYuanyuanandFengYunarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

ZhangHailin,Email:zhangHL715@163.com;FanJianhua,Email:bncdcfjh@163.com

ObjectiveTounderstandtheepidemiologicfeaturesofanoutbreakofdenguefever(DF)inXishuangbannaprefectureofYunnanprovincein2015,withitsviralserum-typeandtransmissionsource.MethodsThedataofDFcasesinXishuangbannaprefecturewerecollected.TheserumsamplesfromacutestageofthesepatientswerecollectedtodetecttheviralnucleicacidbyRT-PCRassay.ThephylogenetictreewasgeneratedandanalyzedbasedonthenucleotidesequencesofC/PrMgenefragmentsofdenguevirus(DENV).ResultsAtotalof1 132casesofDFwerereportedinXishuangbannaprefecturein2015.Ofthem, 1 089wereindigenouscases(96.20%), 43wereimportedcases(3.80%),i.e., 38fromMyanmar, 3fromLaosand2fromThailand.AutochthonousDFoccurredinurbanareaandGasatowanofJinghongcitythattherewasdistributionofAedes aegyptimosquitoes.EpidemicmonthofDFwasfromJulytoDecember.Themajorityofpatientswereagedfrom20to49years-old,withtheyoungest2yearsoldandtheeldest93yearsold.Themaletofemaleratiowas1:1.05.TheresultsofvirusnucleicaciddetectionandsequencingindicatedthatnucleotidesequencesofC/PreMof33virusstrainswereobtainedfromtheDFcases.Phylogeneticanalysisindicatedthatthe33strainsbelongedtoDENVserotype2 (DENV-2),andthestrainfromtheimportedcasesofThailandsharedhighhomologywiththestrainsfromindigenouscasesaswellasbelongedtosameclade.TheseDENV-2strainsfromXishuangbannahadaclosergeneticrelationshipwiththestrainsisolatedfromSoutheastAsia,FujianandGuangdongprovincesofChina,however,distantrelativeswithDENV-2strainsfromRuilicityofYunnanprovincein2014.ConclusionsTheautochthonousDFepidemicoccurredinXishuangbannain2015wascausedbyDENV-2.ThestudyalsosuggeststhatthetransmissionofDFfromThailandtoXishuangbannaofChinawasthemaincauseoftheautochthonousDFepidemic,andAedes aegyptimosquitowasthemaintransmittingvectorinthelocal.ShouldstrengthensurveillanceandmanagementontheimportedcasesandindigenouscasesofDFandmosquitocontrolinthisregionisthekeymeasurestopreventprevalenceofthediseaseonceagain.

Denguefever;Denguevirus;Phylogeneticanalysis;Epidemiology

张海林，Email: zhangHL715@163.com；范建华，Email: bncdcfjh@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.002

2016-06-01)