金叶女贞黑斑病菌分生孢子萌发条件及形态观察

司杰

（信阳师范学院华锐学院，河南信阳464000）

金叶女贞黑斑病菌分生孢子萌发条件及形态观察

司杰

（信阳师范学院华锐学院，河南信阳464000）

金叶女贞叶斑病造成植物大量落叶，是一类重要病害。本实验应用纸环法诱导叶斑病病原菌分生孢子萌发，探讨碳源、氮源、基质酸碱度等生态条件对分生孢子萌发的影响。结果表明，供试的4种碳源中蔗糖、葡萄糖、麦芽糖均能促进分生孢子萌发，蔗糖效果相对较明显，而可溶性淀粉可抑制分生孢子萌发；供试的4种氮源中牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵均能促进分生孢子萌发，其中2种有机氮源效果更明显，而硫酸铵可抑制分生孢子萌发。pH值在3～11范围内该病原菌分生孢子均可萌发，最适pH为7，分生孢子在中性及偏微碱性环境中萌发率较高。

金叶女贞；黑斑病；分生孢子；萌发率

金叶女贞（Ligustrum vicaryi f.）[1]为杂交种。我国1984年从德国和美国引种金叶女贞，枝叶茂密，耐修剪，宜栽培成矮绿篱，多和杜鹃、月季等组成色彩鲜艳丰富的花坛被大量栽种[2,3]。但当植株栽植密，通风透光差时，叶斑病发生严重。发病时，叶片大量脱落，严重影响景观效果[4]。金叶女贞黑斑病的发生和发展，与病原菌的生长和分生孢子的萌发直接相关。本实验的研究可说明，该病原菌分生孢子萌发的几种条件，对于此病的防治有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

由信阳师范学院生命科学学院植物微生态实验室提供金叶女贞黑斑病病原菌菌种。

1.1.2 培养基

PDA固体及液体培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g,水1 000g；碳源及氮源液体培养基：称取蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、牛肉膏、硝酸铵、蛋白胨和硫酸铵，分别配制1%的水溶液，灭菌后作为分生孢子的氮源和氮源培养液。

1.2 方法

1.2.1 金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子的培养

取该病原菌的菌种，接种到PDA固体培养平板上，25℃培养9d。待病原菌菌落覆盖皿底2/3时，用无菌水冲洗新鲜的金叶女贞叶子，并用灼烧过的解剖针在叶子上扎4～6孔，最后将处理过的金叶女贞叶子接种到菌落表面，3～4片每皿。25℃继续培养一周诱导产孢。

1.2.2 碳源对分生孢子萌发的影响

采用纸环法孢子萌发。取培养皿5个，在培养皿及皿盖中放入灭菌后的滤纸片，加无菌水润湿滤纸，放入灭菌载玻片。在每个载玻片上放置3个滤纸环，分别滴加1%的蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖溶液，无菌水作对照组。用牙签挑取分生孢子接种于滤纸环，25℃保湿培养，每2h镜检一次，统计孢子萌发率，连续观察8h，拍照记录孢子萌发形态。

1.2.3 氮源对分生孢子萌发影响

方法同1.2.2，滴加溶液为1%的牛肉膏、硝酸铵、蛋白胨、硫酸铵溶液。

1.2.4 酸碱度对分生孢子萌发的影响

用10%的NaOH溶液和HCl溶液，调节PDA培养液pH值分别为3、5、7、9、11。按1.2.2方法将分生孢子接种于滤纸环后，25℃保湿培养。

2 结果分析

2.1 金叶女贞黑斑病分生孢子及萌发后的形态观察

金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子单生，淡褐色或褐色，圆柱状，直立或弯曲，并有数量不等的隔膜[5，6]。孢子萌发时可在孢子的顶端或侧端等不同位置伸出浅色呈透明状的芽管，芽呈细丝状，随培养时间而增长，有些还会出现分支，如图1所示。

图1 金叶女贞黑斑病菌分生孢子萌发形态

2.2 碳源对分生孢子萌发的影响

经过2h培养后，病原菌分生孢子在培养液中均可萌发，结果如表1所示。

从表1可见，在蔗糖中的萌发率最高已超过50%，在葡萄糖中的萌发率低于无菌水；4h时分生孢子在葡萄糖、麦芽糖、无菌水中的萌发率均迅速上升，达50%以上，说明孢子萌发与培养时间正相关。在可溶性淀粉中的萌发率增长幅度仅8%左右，并落后于无菌水54.4%；6～8h时蔗糖、麦芽糖、葡萄糖中孢子萌发率均已超过90%，高于无菌水，但可溶性淀粉仍低于无菌水。

表1 碳源对分生孢子萌发的影响

实验结果表明，2h时蔗糖中的萌发率最高，说明孢子最容易利用蔗糖，这可能是因为蔗糖参与的代谢途径更多。由于分生孢子本身储存一定的营养物质，且实验中营养液量少，所以除蔗糖外，其他外源碳源所起作用相差不大。4h后葡萄糖中萌发率增长显著，说明在溶液充足时单糖也可明显促进孢子萌发。4～8h，可溶性淀粉低于无菌水，推断可溶性淀粉溶液可抑制该病原菌分生孢子萌发。由以上可知，金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子更易容易利用单糖和双糖，不易利用多糖。

2.3 氮源对分生孢子萌发的影响

在培养2h后，各种培养液中孢子均可萌发，实验结果见表2。

表2 氮源对分生孢子萌发的影响

从表3可知，蛋白胨中的孢子萌发率43.6%最高，硝酸铵、硫酸铵、牛肉膏中的孢子萌发率与无菌水中的相近，其中硝酸铵培养液萌发率19.8%最低；4h后除硫酸铵中萌发率增长较慢外，其他几组均迅速增加，其中牛肉膏、蛋白胨两组有机氮源中的孢子萌发率较高，硝酸铵次之，硫酸铵反比无菌水低；6～8h间，萌发率增长趋势与4h时一致。

结果表明，有机和无机氮源均能促进孢子萌发。其中有机氮源是金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子最易利用的氮源。无机氮源中，硝酸铵高于硫酸铵，且硫酸铵低于对照组无菌水，说明铵态氮不易被分生孢子利用，可能会抑制分生孢子萌发。硝态氮中的萌发率初始也比无菌水低，4、6h时高于无菌水，推测开始时硝态氮的代谢途径未被启动，抑或是溶液的量过少不能满足孢子萌发需要。

2.4 酸碱度对分生孢子萌发的影响

通过2h培养后，分生孢子萌发实验结果如表3所示。

表3 不同pH值对分生孢子萌发的影响

从表3可见，在pH=5、7、9、11的培养液均有孢子萌发，pH=3的培养液中几乎无孢子萌发，pH=9的萌发率最高，为9.32%；4h后pH=3中出现少量萌发的孢子，其他溶液中孢子萌发增多，其中pH=9、11的增长幅度大于pH=3、5；4～8h间pH=3中萌发率最低，且增长幅度很小，8h后才达5.88%，pH=7萌发率已达84.0%，此时间段萌发率的大小顺序均为（pH=3）＜（pH=5）＜（pH=11）＜（pH=9）＜（pH=7）。

结果表明，金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子在酸碱度为3～11的范围内均能萌发，其中pH=3时萌发率最低，pH=7时萌发率最高，即该病原菌分生孢子喜好中性或偏微碱性环境，酸性环境可抑制孢子萌发。

3 结论

金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子萌发实验表明，8种供试溶液中，在萌发早期，蔗糖与蛋白胨最易被利用。随着培养时间的增加，单糖葡萄糖、双糖麦芽糖都可促进孢子萌发，而多糖类可溶性淀粉可在一定程度上抑制孢子萌发；有机氮源牛肉膏、蛋白胨都可较明显地促进金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子萌发，硝态氮次之；铵态氮可在一定程度上抑制孢子萌发；对比碳源和氮源培养液中的萌发率，碳源比氮源对金叶女贞黑斑病病原菌分生孢子的萌发更有利；病原菌分生孢子在酸碱度为3～11的培养液中均可萌发，最适pH=7，喜好中性或偏微碱性环境，强酸性环境可抑制萌发。

花生黑斑病原菌分生孢子在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖中都可以萌发，其中1%蔗糖和木糖萌发效果较好；淀粉营养液却使孢子萌发率比对照（水）低[7]，这些与金叶女贞黑斑病的分生孢子特性相似，但金叶女贞黑斑病的分生孢子喜好中性和偏微碱性的特性与花生黑斑病原菌喜好偏酸性环境[7]的特性相反。番茄早疫病菌分生孢子萌发最适pH=7[8]，与金叶女贞分生孢子特性相似。以上比较结果说明病原菌不同，分生孢子萌发最适碳源、氮源、pH会有差异，但湿度是影响多数病原菌孢子萌发的必要条件[9,10]，温度一般最适为25℃，最适酸碱度接近中性。

由本实验得出的结论可对金叶女贞黑斑病的防治提供一些理论依据，比如可以在病害发生时喷施酸性或含有NH4+的杀虫剂，也许可有效抑制病原菌分生孢子的萌发；建立苗圃时可优先考虑选择偏酸性地块，加强管理，从而有效防止该病害发生。由于时间和条件有限，病原菌分生孢子萌发所需要的其他环境因子如温度、湿度、光照等所带来的影响还有待进一步深入研究。

[1]观赏园艺卷编辑委员会.中国农业百科全书，观赏园艺卷[M].北京:农业出版社,1976.

[2]王国良.金叶女贞轮纹病的初步研究[J].浙江万里学院学报,2000,13(4):189-191.

[3]刘祖伦,王艳洁.优良观叶植物—金叶女贞[J].农业科技通讯,1999,28(2):146-151.

[4]张猛,武海燕,裴洲洋,等.河南省金叶女贞—新病害[J].河南农业大学学报,2008,42(2):220-222.

[5]郭英兰.棒孢菌属四个新种[J].真菌学报,1984,3(3):161-169.

[6]Meenum,Kharwar R N, Bhartiya H D.Some new forms of Corynespora from Kathmandu valley of Nepal[J].Indian Phytopatholo gy,1998,51(2):146-151.

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[9] Beckman P M， Payne G A． Cultural techniques and conditions influencing growth and sporulation of Cercospora zeaemaydis and lesion development in corn [J].Phytopathology,1983,73(2): 286-289．

[10]刘艳平.大豆灰斑病菌分生孢子萌发条件研究简报[J].大豆科学,1988,8(2):64．

Ligustrum Alternaria Spores Germination Conditions and Morphology

Si Jie
(Xinyang Normal University Huarui College, Henan Xinyang 464000)

Ligustrum leaf spot caused by a large number of plant leaves, are an important class of diseases. In this study, paper ring leaf spot pathogen spore germination was induced to explore carbon, nitrogen, matrix pH and other ecological conditions on spore germination. The results showed that the tested four carbon sources, sucrose, glucose, maltose could promote spore germination, sucrose effect was relatively obvious, while soluble starch inhibit spore germination; four nitrogen sources tested beef extract peptone, ammonium nitrate could promote spore germination, two of which organic nitrogen was more effective, and ammonium sulfate inhibits spore germination.pH value in the range of 3～11 the pathogen spores could germinate the optimum pH of 7, conidia in neutral and slightly alkaline environment of high germination rate.

Ligustrum; Melasma; Spores; Germination rate

S436.6

A

2096-0387（2016）02-0031-03

司杰（1988-），女，河南信阳人，硕士研究生，助教，研究方向：微生物学。