Box-Behnken优化富硒豆芽处理条件

王宏,温冬玲，马生健

(岭南师范学院 生命科学与技术学院,广东 湛江,524048)



Box-Behnken优化富硒豆芽处理条件

王宏,温冬玲，马生健*

(岭南师范学院 生命科学与技术学院,广东 湛江,524048)

以有机富硒液体肥为硒源，对豆芽的富硒培育条件进行优化研究。选择热烫温度、热烫时间、有机富硒浓度和浸泡时间作为优化因素，研究各因素的不同水平对富硒豆芽发芽率和硒含量的影响。通过单因素试验和box-behnken设计得出了豆芽富硒处理的最佳条件。结果表明：最佳处理条件为热烫温度49 ℃、热烫时间为10 min,有机富硒浓度为3.5×10-4mg/mL，浸泡时间为6 h，在此条件下富硒豆芽的实测发芽率达到最大值为97.96%，相应地硒含量为14.893 μg/g。

有机富硒液体肥；box-behnken；发芽率；硒含量

硒是人体必需的微量元素之一。硒元素不仅是多种酶的构成成分，同时具有抗氧化、调节甲状腺激素水平、维持正常免疫、预防克山病和大骨节病等作用，还具有抗肿瘤、维持正常生育功能、保护视力、拮抗汞毒等多种生理功能[1]。硒分为无机硒、有机硒。硒盐的毒理分析表明，无机硒均为剧毒，过量摄入硒会导致急、慢性中毒，一般仅用于医药品而不用于食品，其使用范围和剂量都受到限制。有机硒是生物体通过代谢过程将环境中的无机硒通过与体内的生物大分子相结合形成含硒有机物，与无机硒相比，其毒性小而生物活性高[2-3]。

利用无机硒浸泡可显著提高豆芽的硒含量，但由于无机硒的使用存在安全隐患，因此生产上很难推广使用。当前市场上已有使用较安全的有机硒肥，并在多种作物上应用具有较好的富硒效果，但目前鲜有有机硒肥应用于豆芽上的富硒效果研究。故本研究选择有机富硒液体肥为硒源，选择对硒有一定富集能力，而又为消费者经常食用的豆芽菜为对象。

在豆芽的生产过程中品种筛选和籽粒精选是决定着芽苗菜的产量与品质的内因，烫种、浸种和栽培是外因。普通的浸泡、萌发工艺生产富硒豆芽常常遇到萌发率不高、产量不高、富硒效果不佳、质量不佳和烂根等问题[4]。植物种子萌芽是一个较复杂的生物学过程，通过合理科学的种子热烫处理可提高种子发芽率并提高产量等。热烫处理主要是在一定温度下对种子进行水浴热处理，使种皮的透性增大，氧气可以顺利进入，从而使种子内的代谢活动加强，促进三大贮藏物质的分解，达到促进种子生长的目的[5]。本文主要研究热烫、浸种处理及有机富硒浓度对富硒豆芽发芽率和硒含量的影响，并采用响应曲面法中的Box-behnken对影响豆芽发芽率和富硒含量的不同处理条件(热烫温度、热烫时间、有机富硒浓度、浸泡时间)及其相互作用进行研究，从而得出最佳富硒豆芽生产处理条件。

1　材料与方法

1.1试验材料

大豆:当年产的东北大豆(购买于广东省湛江市赤坎区信和超市)，挑选籽粒饱满，无烂或虫蛀的大豆做实验。

1.2 试剂与仪器

1.2.1试剂

绿维康牌有机富硒肥，杨凌奥邦生物科学有限公司生产。产品登记证号：农肥(2008)准字1755号。执行标准: NY1428-2010)。

硒标准储备溶液，于湛江市赤坎区步行街康百公司购买，浓度1 000 μg/mL；硒标准使用液：1.568 μg/mL。

EDTA溶液、KI溶液、醋酸钠溶液(NaAc)、HCl、可溶性淀粉、结晶紫溶液。

1.2.2仪器

HPX-9052ME数显电热恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AUY200精密电子天平，四川成都科恒达仪仪器设备有限公司；GZX-9140MBE型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DFY-200型手提式高级中药粉碎机，青州市三宝中药机械厂。

1.3富硒豆芽工艺流程

黄豆→冲洗→烫种→浸种→萌发(催芽)→采收

1.4单因素试验设计

参照文献[5-9]中的富硒豆芽的处理方法，确定富硒豆芽的基本处理条件分别为，热烫温度为50 ℃、热烫时间4 min、浸泡时间6 h。经过初步预实验与富硒食品含硒量标准[12]确定有机富硒浓度为1×10-4mg/mL，在此基础上设计单因素试验。

1.4.1不同热烫温度对大豆发芽率和硒含量的影响

分别称取6份100 g的大豆洗净后分别置于大烧杯内，按以下方法进行处理：将大豆分别在40、45、50、55、60 ℃温水中烫4 min，然后将处理好的大豆用1×10-4mg/mL绿维康有机富硒液体肥溶液在25 ℃培养箱中浸泡6 h，待浸泡完后，将种子置于底铺纱布的带孔塑料圆盘中，上盖纱布于25 ℃的恒温培养箱中进行培养4 d，每隔12 h喷洒10 mL的蒸馏水。观察培养箱内培养24 h的大豆发芽情况，硒含量采用分光光度计进行测定[10]。比较热烫温度对发芽率和硒含量的影响，确定有利的热烫温度，以未处理的样品做对照。

1.4.2不同热烫时间对大豆发芽率和硒含量的影响

操作方法同1.4.1，改变烫种时间，分别为2、4、8、16、32 min，比较热烫时间对大豆发芽率和硒含量的影响，以未处理的样品做对照。

1.4.3有机富硒浓度对大豆发芽率和硒含量的影响

操作方法同1.4.1，其他条件保持不变，将大豆分别置于不同浓度的绿维康有机富硒肥溶液中浸泡，分别为1×10-4、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4mg/mL,根据我国富硒食品硒含量标准[11]以及人每天推荐摄入硒含量确定较适宜的浓度，以未处理的样品做对照。

1.4.4浸泡时间对大豆发芽率和硒含量的影响

操作方法同1.4.1，在其他因素不变的条件下，分别浸种3、6、9、12、15 h。确定大豆富硒的最佳浸泡时间，以未处理的样品做对照。

1.5实验指标的测定

1.5.1发芽率的测定[6]

发芽率是指经过浸泡、萌发处理后，样品中发芽的大豆数量占样品中大豆总数的百分比。发芽率的测定方法为，从每份萌发好的大豆样品中随机取出3份小样，每份小样的大豆总数在30～50粒之间，计数每份小样中发芽与不发芽的大豆数，即可计算该份小样的发芽率，然后用3份小样发芽率的平均值来代表整份大豆样品的发芽率。大豆发芽的判定标准为伸出大豆种皮的胚根长度大于1 mm。

1.5.2豆芽硒含量测定[10]

1.5.2.1实验原理

利用浓HNO3的强氧化性，将硒氧化成四价，四价硒与I-在酸性介质中得到体积较大的I3-离子与结晶紫大阳离子形成有色缔合物。用分光光度计测定硒(IV)-KI-结晶紫体系吸光度值，应用对照法测定豆芽中硒含量。

1.5.2.2样品处理

取培养结束的豆芽用蒸馏水冲洗，烘干，取出，研成细末，置干燥器中备用。取细粉1.000 g，精密称定，置100 mL烧杯中。加入10 mL浓HNO3浸泡12 h后加热蒸发浸取液近干稍冷，加1 mL H2O2,在稍加热，冷却后滤去残渣，滤液置于250 mL容量瓶中，用纯净水定容，作为待测液。

1.5.2.3硒含量测定

取编号为1、2、3三只25 mL容量瓶，移取1 mL硒标准液于2号瓶中，移取1 mL以处理好的样品液于3号瓶中，在3只容量瓶中均依次加入9 mL HCl、2.5 mL KI、2 mL NaAc、2 mL淀粉溶液、2 mL结晶紫，以水定容，摇匀。配好溶液稳定10 min后，用1 cm比色皿，在波长544 nm处以1号瓶溶液为参比液测定吸光度值，硒含量(X)记录。

式中:A样，样品的吸光度值； A标，硒标液的吸光度值；c标,硒标准溶液溶度μg/mL；m,样品质量g；V,定容后滤液体积，mL。

1.6Box-behnken实验设计

根据上述的单因素试验结果，采用Design-Expert 8.0.5软件，分别选择单因素实验中的4个不同因素的3种不同水平进行优化实验。以热烫温度(℃)(X1),热烫时间(min)(X2)、有机富硒浓度(10-4mg/mL)(X3)、浸种时间(h)(X4)为主要考察因素，因素水平设计见表1。

1.7数据处理

每个样品试验重复3次，取平均值。采用Excel 2007和Design-Expert 8.05进行设计和分析，数据采用方差(ANOVA)，当P<0.05时表示差异性显著，P<0.01表示极显著。

表1　Box-behnken实验因素水平编码

2　结果与分析

2.1单因素实验结果与分析

2.1.1热烫温度与时间对大豆发芽率和硒含量的影响

如表2所示,与未热烫处理的大豆相比较，在热烫温度40～50 ℃内，随着温度的升高，大豆24 h发芽率与硒含量都呈现增加趋势，但温度为60 ℃，发芽率明显下降，大豆硒含量也减少，原因是温度过高，对大豆造成器质上的伤害[12]。当热烫温度为50 ℃ 时，随着热烫时间的延长各项指标呈现先升高后降低的变化，当热烫时间为8 min时，发芽率最高，硒含量也较高。这说明热烫时间过短，对大豆的刺激不够，生长缓慢，吸收硒溶液较慢。但热烫时间过长，大豆无氧呼吸增强反而会丧失部分发芽能力，抑制种子的萌发，也在一定程度上影响其硒溶液的吸收。

表2　热烫温度与时间对大豆发芽率和硒含量的影响

2.1.2有机富硒浓度与浸泡时间对大豆发芽率和硒含量的影响

从表3可以看出，用有机富硒肥浸泡的大豆的发芽率明显高于未处理组，而且发芽率与硒含量随着浓度的增大而增大，含硒量是未处理组的10多倍。说明有机富硒肥可以缩短大豆发芽时间，提高发芽率，还能显著提高大豆的硒含量，达到很好的富硒效果,与有机富硒肥产品功能介绍相符。随着浸泡时间的升高，大豆在24 h发芽率呈现先升高后降低的趋势，说明长时间浸泡，大豆无氧呼吸增强反而会丧失部分发芽能力，抑制种子的萌发。硒含量在3～9 h是不断增加的，增加的幅度较大，而在12～18 h时变化不大。说明浸泡时间到一定程度时，大豆吸收硒溶液达到了一个饱和状态。

表3　有机富硒浓度与浸泡时间对大豆发芽率和硒含量的影响

2.2Box-behnken设计优化实验结果与分析[13-14]

根据试验因素和水平的设计，采用不同的热烫温度、热烫时间、有机富硒浓度和浸泡时间处理大豆，利用Design-Expert 8.0.5软件共进行了29次实验，并分别对大豆发芽率和硒含量进行评定。实验设计和结果见表4。

表4　实验设计与结果

通过析因实验和中心试验，以析因点为自变量取值在热烫温度X1，热烫时间X2、有机富硒浓度X3和浸泡时间X4所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，中心点试验5次，用以估计试验误差。对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表5。

由表5知，大豆发芽率模型(P<0.000 1)达到极显著水平，且有很好的确定系数。方差分析中，热烫温度(X1)、热烫时间(X2)、有机富硒浓度(X3)和浸种时间(X4) 对大豆发芽率影响是显著的(P<0.05)。

表5　大豆发芽率响应曲面二次模型的方差分析

注：P<0.05显著，P<0.001极显著。

回归诊断显示，多元相关系数(R2)=0.975 1，表明方程拟合度和可信度较高。失拟项P=0.219 9>0.05不显著，表明可用二次回归方程模型代替试验点对试验数据进行分析。综上，该回归模型可用于大豆发芽率的响应值预测。

根据Design-Expert 8.05软件得到的二次回归方程如下：

发芽率/%=+96.24-4.12X1-1.89X2+1.41X3-2.15X4-2.37X1X2-1.18X1X3-2.36X1X4-0.26X2X3-1.84X2X4-0.45X3X4-5.83X12-3.12X22-1.94X32-1.02X42

硒含量=+9.10-0.17X1-0.034X2+1.66X3+0.18X4-0.19X1X2-0.14X1X3-0.011X1X4-0.064X2X3+0.17X2X4-0.23X3X4-0.55X12+8.708E-003X22+0.37X32-0.18X42

根据实验设计与结果，可由Design-Expert 8.05软件得到图1。

图1　各种因素对大豆发芽率的交互影响Fig.1　Effect of interaction of each fators on germination rate of soybeans

图1为各个因素之间的相互作用对大豆发芽率的影响。从图1-a可以看出，热烫温度和热烫时间对大豆发芽率的影响是显著的。在一定的热烫时间下，随着热烫温度的上升，发芽率呈现先增大后降低，曲面坡度变化较大，在接近50 ℃时，达到最大值。热烫温度一定时，发芽率随着热烫时间的延长也呈先增大后减少趋势。

图1-b显示，热烫温度和有机富硒浓度对大豆发芽率的影响是显著的。热烫温度在上升过程中，大豆发芽率先增加后减少，当热烫温度为50 ℃左右时，发芽率达到最大值；有机富硒浓度不断上升过程中，大豆发芽率也不断增加，曲面坡度比较陡。图1-c、图1-d同理进行分析得出浸泡时间与热烫温度，热烫时间之间都存在一定的相互作用。

2.3模型优化和验证

通过对二次回归模型的分析，在设定大豆发芽率最大的前提下，以硒含量为指标，确定富硒豆芽最佳处理条件见表6。

表6　富硒豆芽的优选理论工艺参数

综合以上分析结果，采用优化的富硒豆芽处理条件进行富硒豆芽的评定验证试验，热烫温度为49 ℃，热烫时间为10 min，有机富硒浓度为3.5×10-4mg/mL，浸泡时间为6 h，重复试验3次，结果取3次的平均值。豆芽发芽率为97.96%，硒含量为14.893 μg/g，这表明理论值和实际值之间具有良好的拟合性，优化模型可靠。

3　结论

本试验利用Box-behnken对富硒豆芽的处理条件进行了优化，确定最佳处理条件为热烫温度49 ℃，热烫时间为10 min,有机富硒浓度为3.5×10-4mg/mL，浸泡时间为6 h，在此条件下富硒豆芽的实测发芽率达到最大值为97.96%，相应地硒含量为14.893 μg/g.

中国营养学会推荐的成年人硒摄入量为50～250 μg/d[12]，依照经过3.5×10-4mg/mL有机硒溶液处理后豆芽含硒量及我国的RDA标准，成人每天只需摄入15 g该富硒豆芽就能满足中国营养学会的RDA标准。由于有机硒容易被吸收，如果按照人每天摄入量100 g计算，则浸泡处理大豆的有机硒浓度将要更低。

本文对豆芽进行富硒处理就是其中一种富硒产品。而对豆芽富硒处理可以采用浸泡和喷洒的方式，而本论文实验对豆芽采用的是有机硒浓度浸泡的方式，喷洒方式对硒含量的影响有待进一步研究。

[1]张俊杰.硒的生理功能及富硒强化食品的研究进展[J].微量元素与健康研究,2006，23 (3)：58-60.

[2]张驰，刘信平，周大寨，等.绿豆芽对硒的富集及耐受能力研究[J].北方园艺，2005，10 (2)：46-47.

[3]郑建仙，李漩.硒的天然有机化及在富硒谷物食品[J].食品工业，1997，1(3)：25-27.

[4]林源,卜海东.烫浸种处理对绿豆芽萌发与生长影响的研究[J].北京农业，2010，9 (5): 73-76.

[5]袁云香.不同烫种条件对绿豆芽生长的影响[J].科学技术与工程，2012，12 (28):51-53.

[6]郑传进，吴小勇，杨洋,等.浸泡及萌发条件对大豆富硒作用的影响[J].食品工业科技，2013，34(5):109-110.

[7]宋玉，刘昆仑，韩永斌，等.浸泡条件对发芽大豆中硒富集量的影响[J].食品与发酵工业，2011，37(7):112-114.

[8]曹建，李植良，谭青，等.浸泡时间对小豆种子萌发及生长的影响[J].广东农业科学，1999，11(3):25.

[9]刘珂.热击及水合处理对豆芽生产的影响研究[D].南京：南京农业大学，2012:21-40.

[10]周权，张娜.分光光度法测定中草药黄芪中硒含量[J].黄山学院学报，2008，10(3):48-50.

[11]张欣，谢义梅，周灵，等.富硒食品含硒量范围标准的研究[J].微量元素与健康研究，2013,30(1):41-43.

[12]吴旭红，冯晶旻.微波热击处理对大豆种子萌发及活力的影响[J].微波学报，2011，27(5)：94-95.

[13]张泽志，韩春亮，李成未.响应面法在实验设计与优化中的应用[J].河南教育学院学报：自然科学版，2011，20(4):35-37.

[14]丁健峰，孙永海，付天宇，等.响应曲面法优化羊肚菌富硒深层发酵条件[J].吉林大学学报，2013，43(3)：561-562.

[15]李丽辉,林亲录.我国富硒食品的研究进展[J].中国食物与营养,2007(2):23.

Optimization of the processing conditions of the selenium-enriched bean sprouts with box-behnken design

WANG Hong, WEN Dong-ling， MA Sheng-jian*

(Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048,China)

This paper optimize the cultivation conditions of selenium-enriched sprouts by taking selenium-rich liquid fertilizer as organic selenium source. Blanching temperature, blanching time, concentration of selenium fertilizer and soaking time were selected as the factors in optimization, the effect of different factors to the germination rate and selenium content of selenium-enriched bean sprouts were studied. The optimum processing conditions for selenium-enriched bean sprouts were determined by single factor experiment and Box-behnken design. The results showed that the best conditions were: blanching temperature 49 ℃, blanching for 10 min, at selenium fertilizer 3.5×10-4mg/mL, soaking for 6 hours. Under the above conditions, the maximum germination rate was 97.96% and selenium content of selenium-enriched bean sprouts was 14.893 μg/g.

organic elenium-riched liquid fertilizer； box-behnken； germination rate； selenium content

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601021

硕士，副教授(马生健副教授为通讯作者，E-mail：mashengjian1@163.com)。

国家星火计划资助(2013GA780088)；湛江市热带特色资源植物技术开发重点实验室项目(2014A06008)

2015-04-29，改回日期：2015-09-16