侧柏叶乌发活性成分探究△

高旦，刘叶，惠小维，包海鹰

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

侧柏叶乌发活性成分探究△

高旦，刘叶，惠小维，包海鹰*

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

目的：研究侧柏叶CacluneuPlatycladi的主要化学成分对酪氨酸酶活性的影响，从而确定侧柏叶乌发作用的有效组分。方法：通过提取得到侧柏叶所含的挥发油、总黄酮、鞣质以及树脂，采用蘑菇酪氨酸酶速率氧化法体外测定酪氨酸酶活性。结果：挥发油、鞣质均表现为轻度的抑制作用，而总黄酮则表现较强的抑制作用，树脂表现出较强的激活作用。结论：侧柏叶中具有乌发作用的活性组分可能是树脂。

侧柏叶；侧柏叶化学成分；酪氨酸酶活性

侧柏叶(Platycladi cacumen)又名丛柏叶，是侧柏的干燥嫩枝梢及叶。中医认为侧柏叶气清香，味苦涩，性寒，归肺、肝、脾经。具有凉血止血、化痰止咳，生发乌发之功。用于吐血，魈血，咯血，便血，崩漏下血，肺热咳嗽，血热脱发，须发早白[1]。

明代李时珍《本草纲目》中记载侧柏叶“乃多寿之木，所以可以入服食。道家以之点汤常饮。”侧柏叶作为传统的中药，其乌发功能一直被人忽略。而在诸多古代文献中记载其主要功能为乌发和生发，在《本草纲目》中谓其：浸油，生发，烧汁，黑发。和猪脂，沐发长黑。然而侧柏叶乌发的机理尚不明确[2]。

白发的病因与发病机理复杂，现代医学研究认为，可能与遗传、衰老、疾病等导致的黑素干细胞衰老、黑素细胞减少等有关，机制包括bcl-2基因缺失、氧化损伤、氧化应激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表达量减少或活性降低是一个重要的因素[3-4]。酪氨酸酶是体内黑素合成的主要限速酶，酪氨酸酶活性降低将使体内黑素合成的反应进行得十分缓慢[5]。目前研究表明，侧柏叶主要含有黄酮、挥发油、鞣质、树脂、微量元素等化学成分[2]，本实验选侧柏叶的主要化学成分进行研究，考察侧柏叶是否通过某种化学成分直接激活酪氨酸酶的催化活性而促进黑色素的形成，为进一步研究侧柏叶的乌发机理提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 药品

侧柏叶购自山东省济宁市侧柏种植基地，经吉林农业大学中药材学院包海鹰教授鉴定为侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶。

1.2 试剂

蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-多巴(L-Dopa)均购自美国Sigma公司；磷酸酶氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇、石油醚、乙酸乙酯均为分析纯。

1.3 仪器

721型分光光度计(上海第三仪器分析厂)。

2 方法与结果

2.1 磷酸缓冲溶液(PBS)的配制

称取0.2 mol·mL-1磷酸二氢钠溶液250 mL，加0.2 mol·mL-1的氢氧化钠溶液118 mL，用水稀释至1000 mL，定容，即得。

2.2 酪氨酸酶溶液的配制

称取13.28 g(25 KU)蘑菇酪氨酸酶(1881 U·mg-1)，用PBS定容至25 mL，即1 KU·mL-1，分装-20 ℃保存，临用时室温平衡，即得，稀释至实验所需浓度143 U·mL-1。

2.3 L-多巴溶液的配制

精密称取197.19 mg L-多巴，用PBS溶液定容至100 mL，须现用现配，浓度为197.19 g·mol-1。

2.4 侧柏叶中总黄酮的提取

称取侧柏叶2.5 kg，用65%乙醇回流提取2次，提取时间1.5 h，每次料液比1∶15，合并提取液，离心取上清液，浓缩干燥得浸膏，在室温下干燥，备用。取部分干燥后的乙醇提取物，加一定量的蒸馏水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，用旋转蒸发仪减压浓缩，在室温下干燥，备用。称取部分乙酸乙酯萃取物，用10%乙醇溶解，离心(3000 r·min-1)，用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，得到的纯化产物置于干燥器中保存备用，即为侧柏叶中的总黄酮。

2.5 侧柏叶中挥发油的提取

称取新鲜的侧柏叶2.5 kg，用石油醚(30～60 ℃)进行回流提取，提取时间3 h，料液比1∶12.5，合并提取液浓缩，干燥。取干燥后的适量提取物，放入挥发油提取器中，用水蒸气蒸馏法进行提取，得黄色透明液体1.2 g。

2.6 侧柏叶中树脂的提取

按照上述挥发油的提取工艺，提取挥发油后剩余的提取液，干燥浓缩，即为侧柏叶中的树脂成分。

2.7 侧柏叶中鞣质的提取

称取新鲜的侧柏叶2.5 kg，用65%的含水丙酮在室温下高速搅碎机内破碎成匀浆状，甩滤，反复操作3次，合并滤液，减压浓缩，得到粗的总鞣质。

2.8侧柏叶中主要化学成分对酪氨酸酶活性的影响

将上述提取所得到的主要化学成分用适量二甲基亚砜溶解，然后用PBS定容，制成浓度分别为10、20、30 mg·mL-1的3个浓度梯度。以L-多巴溶液为底物，在3 mL的PBS的测活体系中，先加入0.1 mL不同浓度的提取物于比色杯中，再加入2.8 mL预先在37 ℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入0.1 mL蘑菇酪氨酸酶溶液，立刻混匀，在37 ℃恒温条件下测定波长为475 nm的吸光度值[6]。

根据在475 nm下的吸光度值，计算侧柏叶的主要化学成分对酪氨酸酶的激活率(%)，并将酶活性激活率(%)达到50%时激活剂的浓度测定为IC50值。同时以不加样品的测活体系为空白对照。激活率(%)可以根据下式进行：

激活率=[(C-D)-(A-B)]/(A-B)

其中：A=A475-药+酶；B=A475-药-酶；

C=A475+药+酶；D=A475+药-酶

2.9 数据分析

侧柏叶中挥发油、总黄酮、总鞣质、树脂对酪氨酸酶活性的影响见表1～4。

表1 侧柏叶中挥发油对酪氨酸酶活性的影响

表2 侧柏叶中总黄酮对酪氨酸酶活性的影响

表3 侧柏叶中总鞣质对酪氨酸酶活性的影响

表4 侧柏叶中树脂对酪氨酸酶活性的影响

由表1可知，侧柏叶中的挥发油对酪氨酸酶有轻度的抑制作用，并且抑制作用随着浓度增大有逐渐增大的趋势。

由表2可知，侧柏叶中的总黄酮对酪氨酸酶有显著抑制作用，并且在药物浓度达到30 mg·mL-1时，抑制率达113.34%，与陈兴芬报道的侧柏叶中总黄酮对酪氨酸酶的抑制作用随黄酮浓度的增大而增大基本一致[2]。由表3可知，侧柏叶中的鞣质对酪氨酸酶也有轻度的抑制作用。由表4可知，侧柏叶中的树脂对酪氨酸酶有显著的激活作用，在药物浓度达到30 mg·mL-1时，激活率达102.13%，这与《本草纲目》中“浸油，生发，烧汁，黑发。和猪脂，沐发长黑”的记载不谋而合。

3 讨论

侧柏叶中的树脂类成分对酪氨酸酶有显著的激活作用，可能是侧柏叶一直作为乌发中药的活性成分，但其活性单体成分有待进一步探究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：215-216.

[2] 陈兴芬.侧柏叶化学成分提取及活性功能研究[D].南京：南京师范大学，2011.

[3] 付庆霞,王海苹.白发病因与发病机理研究现状[J].光明中医,2009,24(2):375-377.

[4] Ken I，Takahiro A，Nguyen TB，et al.Genotoxic；stress abrogates renewalolMelanoc；yte stem cells by triggering their differentiation[J].CeLL，2009，137：1088-1099

[5] Prota G.Progress in the chemistry of melanin and related metabolites[J].Med Re s Rev，1988，8：525-556.

[6] HanamuraT，UchinaE，Aoki H.Skinlightening effect of a polyphenol extract from acerola(malpighiaemarginata DC.)fruit on UV-induced pigmentation[J].BiosciBiochem，2008，72(12)：3211-3218.

StudiesonCharacteristicofHairBlackingIngredientinCacumenPlaycladi

GAO Dan，LIUYe，HUIXiaowei，BAOHaiying*

(CollegeofChineseMedicinalMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

Objective：To study the main chemical compositions of Cacumen Platycladieffect on tyrosinase activity，so as to determine the Cacumen Platycladiufa role of effective component.Methods：Volatile oil，flavonoids，tannins and resin were extracted from Cacumen Platycladiis，tyrosinase activity was measured by the rate of mushroom tyrosinase oxidation methodinvitro.Results：The volatile oil，the tannins were characterized by mild inhibitory effect，and inhibition of flavonoids was stronger，resin showed stimulating effect.Conclusion：The hair blacking role of Cacumen Platycladi，may be due to the resin.

Cacumen Platycladi；chemical compositions of Cacumen Platycladi；activity of tyrosinase

2015-09-24)

吉林农业大学大学生科技创新基金(20150320)

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包海鹰，教授，研究方向：中药学；E-mail：baohaiying2008@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.014