活血复脉丸质量标准研究

刘青，赖杰仁，付辉政，王栋*

(1.江西省药品检验检测研究院，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004；3.九江市中医院，江西 九江 332000)

·中药工业·

活血复脉丸质量标准研究

刘青1，2，赖杰仁3，付辉政1，王栋1*

(1.江西省药品检验检测研究院，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004；3.九江市中医院，江西 九江 332000)

目的：建立活血复脉丸的质量标准。方法：采用薄层色谱法鉴别活血复脉丸中丹参、三七、延胡索；采用高效液相色谱法测定丹酚酸B的含量。结果：薄层鉴别色谱中特征斑点明显，重复性较好。丹酚酸B在0.202 0～4.040 0 μg呈良好的线性关系，丹酚酸B的平均回收率为101.4% (n=6)，RSD=0.7% (n=6)。结论：通过研究建立了活血复脉丸的质量标准。

活血复脉丸；丹酚酸B；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量控制

活血复脉丸由丹参、三七、延胡索等八味中草药组成，为九江市中医院在多年治疗心脑血管病临床实践基础上研制而成的心脑血管科协定处方。因其临床疗效较满意，为便于临床使用，故进一步制成浓缩丸剂，并申请院内制剂。活血复脉丸具有活血化瘀、行气通脉、通络止痛的功能。临床用于冠心病、脑动脉硬化脑梗塞、冠状动脉介入手术(PCI)后再狭窄能防治等。为了有效地控制该产品的质量，保证安全性和有效性，本实验采用TLC法对活血复脉丸中丹参[1-3]、三七[1，4-5]、延胡索[1，6]进行定性鉴别研究，并运用HPLC法同时测定其中丹酚酸B的量[7-8]，为该制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦LC1100高效液相色谱，四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、安捷伦色谱工作站；电子天平(Sartoris BS110S十万分之一天平)。

1.2 试药

活血复脉丸(九江中医院药业有限公司，批号分别为20140401，20140402，20140403，20140404)；丹参对照药材、三七对照药材、延胡索对照药材、丹参酮ⅡA、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、延胡索乙素、丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，批号分别为120923-201415，120941-201410，120928-201208，110766200528，110703-201529，110745201318，110726-201213，111562-20154)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为娃哈哈饮用纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 丹参薄层鉴别

取本品5 g，加乙醚10 mL，振摇，放置1 h，滤过，药渣备用，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液[1-3]。另取丹参对照药材同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成质量浓度为2 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应位置上，显相同的暗红色斑点。见图1。

注：1.阴性；2、3、4.供试品；5.对照药材；6.对照品。图1 丹参薄层色谱鉴别

2.2 三七薄层色谱鉴别

取2.1项下备用药渣，挥干，加甲醇50 mL，超声处理30 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水50 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次60 mL，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[1，4-5]。另取三七对照药材0.2 g，加甲醇20 mL，同法制成对照药材溶液。再对照品加甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。见图2。

注：1.阴性；2、3、4.供试品；5.对照药材；6.对照品。图2 三七薄层色谱鉴别

2.3 延胡索薄层色谱鉴别

取本品10 g，加甲醇50 mL，超声处理30 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加浓氨试液至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[1，6]。另取延胡索对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各3 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以环已烷-丙酮-甲醇(4.5∶1∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3 min后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图3。

注：1.阴性；2、3、4.供试品；5.对照药材；6.对照品。图3 延胡索薄层色谱鉴别

3 丹酚酸B的HPLC含量测定

3.1 色谱条件

YMCC18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶5∶1∶64)为流动相；检测波长：286 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，丹酚酸B与其他组分的色谱峰分离度良好。色谱图见图4。

注：A.缺丹参阴性对照溶液；B.丹酚酸B对照品溶液；C.活血复脉丸供试品溶液。图4 HPLC含量测定色谱图

3.2 对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成质量浓度为0.2 mg·mL-1的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[1，7-8]。

3.4 线性关系考察

取对照品丹酚酸B 20.20 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并定容，摇匀，得丹酚酸B(0.189 3 mg·mL-1)的对照品溶液，分别吸取1、2、4、6、8、10、20 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程：Y=506.13X+4.467 9(r=0.999 9)。丹酚酸B进样量在0.202 0～4.040 0 μg与峰面积呈良好线性关系。

3.5 精密度试验

精密吸取按3.2项下方法项下方法制备的对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下连续进样6次，测定峰面积。结果丹酚酸B峰面积的RSD为0.2% (n=6)，表明仪器精密度良好。

3.6 重复性试验

取同一批活血复脉丸6份，每份约0.5 g，精密称定，按3.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，丹酚酸B的平均质量分数为11.814 1 mg·g-1，RSD为2.1%，表明该方法有良好的重复性。

3.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，测得丹酚酸B峰面积的RSD为1.4% (n=6)，说明供试品溶液在24 h内稳定。

3.8 回收率试验

采用加样回收法，精密称取已知含量(丹酚酸B质量分数为11.814 1 mg·g-1)的活血复脉丸6份，每份约0.25 g，加入甲醇25 mL，超声提取30 min，精密量取10 mL，每份精密加入含丹酚酸B 0.193 0 mg·mL-1(精密称取丹酚酸B对照品20.60 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得)的对照品溶液15 mL，按3.3项下方法制备供试溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，计算回收率。结果丹酚酸B的平均回收率(n=6)为101.4%，RSD为0.7%。见表1。

表1 丹酚酸B回收率试验结果(n=6)

3.9耐用性试验

取本品照3.1项下方法试验，分别用A：YMC C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)、B：YMC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、C：waters C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3 种品牌的色谱柱按正文中的色谱条件对其进行测定，含量测定结果无明显差别。

3.10 样品测定

分别取不同批号的活血复脉丸4批，每个样品取3份，按3.3项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μL，在上述色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法计算出丹酚酸B的含量，测定结果见下表2。

表2 活血复脉丸中丹酚酸B的含量(n=3)

4 讨论

4.1 专属性考察

本实验选择的薄层色谱条件下，丹参、三七和延胡索供试品色谱与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同的颜色斑点，阴性样品无干扰。

4.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对丹酚酸B对照品色谱峰进行光谱扫描，结果丹酚酸B在286 nm波长处有最大吸收，由于286 nm杂峰对目标峰干扰少且稳定，故选择286 nm作为检测波长。

4.3 提取方法的选择

比较了甲醇加热回流提取、甲醇超声提取2种提取法，结果表明，超声提取法提取效率大于加热回流提取法。实验过程中比较了提取时间(30、60、90 min)和甲醇浓度(30%、50%、70%、90%、100%)，结果表明，提取为30 min可将丹酚酸B完全提取，甲醇浓度为70%时，提取效率高于其他比例。

4.4 色谱条件的优化

本实验通过摸索乙腈与甲酸水溶液、甲醇与甲酸水溶液以及甲醇、乙腈与甲酸水溶液按一定比例混合作为流动相，考察其分离度，结果以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶5∶1∶64)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃的色谱条件下供试品中丹酚酸B与其他共存组分峰能达到良好的分离。

本实验建立了活血复脉丸中丹酚酸B的HPLC含量测定方法，并对方中主要药味丹参、三七、延胡索进行了TLC定性鉴别。结果表明，所建立的方法操作简便、结果可靠、重复性好。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 夏崇才，周芙琼，顾宁.HPLC法测定冠心ⅴ号合剂中丹参酮ⅡA含量[J].亚太传统医药，2015，11(1)：30-32.

[3] 汪祺，孙磊，郑笑为，等.冠脉宁片(胶囊)现行标准中丹参薄层鉴别比较研究[J].时珍国医国药，2014，25(11)：2667-2669.

[4] 周迎春，赵怀清，梁宁.高效液相色谱法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1、Re、Rb1与三七皂苷R1含量[J].沈阳药科大学学报，2003，20(1)：27-31.

[5] 王术玲.人参、三七、黄芪的薄层鉴别[J].中国药品质量标准，2003，4(2)：48-50.

[6] 吕子明，孙武兴，段绪红.延胡索化学成分研究[J].中国中药杂志，2012，32(7)：235-237.

[7] 任萃文，杨晶.丹参舒心胶囊质量标准研究[J].中国现代中药，2013，6(15)：507-509.

[8] 许永，赵成.不同提取方法对丹参中丹酚酸B含量测定的影响[J].安徽医药，2009，13(10)：1193-179.

InvestigationonQualityStandardofHuoxueFumaiPills

LIUQing1，2，LAIJieren3，FUHuizheng1，WANGDong1*

(1.JiangxiProvincialInstituteforDrugandFoodControl，JiangxiProvincialEngineeringResearchCenterforDrugandMedicalDeviceQuality，Nanchang330029，China；2.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004，China；3.JiujiangHaspitalofTraditionalChineseMedicine,Jiujiang332000,China)

Objective：To establish a quality standard of Huoxue Fumai Pills.Methods：SalviamiltiorrhizaBge.，Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen andCorydalisyanhusuoW.T.Wang in Huoxue Fumai Pills were identified by TLC.Salviandic acid B in Huoxue Fumai Pills was determined by HPLC.Results：Characteristic spots could be detected by TLC and the method had good reproducibility.The linear range of salviandic acid B was 0.203 6 ～ 2.850 4 μg (r=0.999 9).The average recovery rate was 101.4% and RSD was 0.7% (n=6).Conclusion：The established method can be used for the quality control of Huoxue Fumai Pills.

Huoxue Fumai Pills；salviandic acid B；TLC；HPLC；quality control

] 王栋，主任药师，研究方向：中药活性成分及质量标准研究；Tel：(0791)86217386；E-mail：fhzfhz620@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.024

2016-01-04)

△[