五味子水提工艺优化及液质联用测定方法研究△

王梅，刘明明，梁晨光，史鑫波，白宏博，宋忠兴，刘妍如，唐志书*

(1.陕西中医学院附属医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

·中药工业·

五味子水提工艺优化及液质联用测定方法研究△

王梅1，刘明明2，梁晨光2，史鑫波2，白宏博2，宋忠兴2，刘妍如2，唐志书2*

(1.陕西中医学院附属医院，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

目的：以Plackett-Burman-Central Composite Design(PB-CCD)设计为基础，通过分析五味子的LC-MS/MS液质联用仪测出的谱图优选五味子的水提工艺。方法：以五味子醇甲及五味子酯甲的含量为指标，以浸泡时间、液固比、溶剂PH值、提取时间、提取次数、提取温度及浓缩温度为考察因素，采用PB-CCD优选水提工艺条件并进行含量测定分析。结果：选定最佳提取工艺为浸泡时间2 h，提取时间1 h，提取温度70 ℃，提取次数5次，溶剂pH值5.0，浓缩温度60 ℃。结论：PB-CCD优选五味子提取工艺方法简单，可为五味子的提取生产工艺提供参考。

PB-CCD实验设计；液质联用；五味子；五味子醇甲；五味子酯甲

五味子系木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)的干燥成熟果实。化学研究表明，其主要成分为五味子醇甲、五味子酯甲等联苯环辛烯型木脂素类成分，具有降低血清谷丙转氨酶的作用，临床上用于治疗急、慢性肝炎[1-3]。目前研究显示，五味子及含有五味子的中药复方制剂在治疗糖尿病、抑郁症、失眠、慢性肾炎方面有显著疗效。同时，其主要成分五味子醇甲对β-淀粉样蛋白损伤PC12细胞显示出一定的保护作用，提示五味子对阿尔茨海默病治疗的潜力[4-7]。目前，国内多采取正交设计或均匀设计法优化中药的提取工艺，这两种方法多采用线性数学模型，虽然具有简便、试验次数较少等优点，但精确度不太高。而PB-CCD是近几年来国外药学工作者常用的集数学和统计方法于一体的试验设计方法，其原理是根据与实验中心点距离相等的试验点，以自变量的极端水平为试验所允许的极值，通过一次设计，计算结果可得到较佳条件。与常用的试验设计，如均匀设计相比，其精度较高、操作简便。效应面优化法通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面上选择较佳的效应区，从而反推出自变量的优化取值范围，即最佳试验条件[8-9]。本试验以五味子中的主要成分五味子醇甲和五味子酯甲的提取率为指标，引入PB-CCD试验设计方法，在优化五味子水提工艺的同时，进一步探讨应用于优化中药提取工艺的可行性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱串联AB SCIEX 4500 Qtrap 三重四级杆线性离子阱质谱仪(美国Agilent公司，美国AB SCIEX公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；GeneVac miVac 低温离心浓缩仪(英国GeneVac公司)；Sartorius CPA225D 十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 试药

五味子醇甲、五味子酯甲(中国食品药品检验研究所，批号分别为110857-201412，111529-200604)；乙腈为色谱纯(Honeywell公司，批号分别为：DK268和364)；水为娃哈哈纯化水；其余试剂均为分析纯。

五味子购于陕西兴盛德药业有限责任公司，经陕西中医药大学副教授刘世军鉴定为木兰科植物五味子Schisandrachinensis的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 PB-CCD五味子的水提工艺优化

根据工业化大生产成本低、效果高的原则，选择水回流法进行提取。预试验结果显示，五味子水回流提取的影响因素有：浸泡时间、溶剂pH值、提取温度、提取时间、提取次数、溶剂倍量及浓缩温度。

2.1.1 Plackett-Burman试验设计 为了在最少的试验次数下获得最佳的参数设置，选择因子设计中的Plackett-Burman法作为筛选设计方法，见表1。

表1 影响因子及响应因子设计表

表2 Plackett-Burman响应因子设计与结果

2.1.2 设计结果与试验结果 由表中数据得出，提取物中五味子醇甲含量与溶剂pH成正比，与浓缩温度成反比；提取物中五味子酯甲含量与溶剂pH成反比，与浸泡时间成正比，与提取次数成正比。其中液固比、提取时间两个因素对提取物中五味子醇甲及五味子酯甲含量无明显影响。综合分析pH、浓缩温度、提取次数对模型有明显的影响。pH、浓缩温度和提取次数3个因素进行优化，其他因素(浸泡时间、提取时间、提取温度、液固比)从最大值中选择。根据各影响因子对各响应因子的最大值运算结果，将影响不显著的因子进行最大值预测，并作为固定条件：提取温度40 ℃，液固比12 v·m-1，浸泡时间2 h，提取时间1 h。

2.1.3 Central Composite Design试验设计 在PB设计结果的基础上，对溶剂PH值、提取次数和浓缩温度因素进行寻优。试验采用通用旋转组合设计(Rotatable=6)，根据PB-CCD的原理，每因素设五水平，用代码值-α、-1、0、1、α表示(三因素星点设计的α=1.682)。代码值所代表的实际操作物理量见表3，试验安排与结果见表4。

表3 提取工艺影响因素星点设计水平

表4 试验设计与结果

2.1.4 工艺参数优化 五味子醇甲含量随提取次数升高而升高；其他两个变量pH值和浓缩温度对五味子醇甲影响不显著，见图1。

注：A.五味子醇甲提取响应曲面分析图；B.五味子醇甲提取效果影响因素主效应图。图1 提取次数与浓缩温度对提取含量效应面图

五味子酯甲含量随提取pH值升高而降低，浓缩温度对五味子酯甲含量影响不显著，在80 ℃时达到最低点，见图2。

五味子醇甲及五味子酯甲在提取物中含量的3个影响因素(pH、提取次数、浓缩温度)都随着提取次数增加而增加，因此将次数增加为5次。最后选定条件为提取次数为5次，pH=5.0，浓缩温度为60 ℃，见表5。

注：A.五味子酯甲提取响应曲面分析图；B.五味子酯甲提取效果影响因素主效应图。图2 提取液PH值的效应面图

序号pH提取次数浓缩温度/℃五味子醇甲峰面积五味子酯甲峰面积15 125 0060 00125920782742 725 145 0060 00125920982588 135 085 0060 00125921082959 345 195 0060 07125920982160 155 134 9960 00125685882672 765 644 9760 00125514079341 174 405 0060 00125920887431 685 225 0060 68125920881374 894 005 0060 49125920989533 0107 155 0060 00125920669403 2117 325 00100 00125920779111 3127 245 00100 00125920979647 2137 965 00100 00125917074910 2146 705 00100 00125920783157 3156 675 0078 81125920764315 3166 495 0082 68125920866751 3176 565 0082 93125920866395 5

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 分别取五味子醇甲对照品1 mg，五味子酯甲对照品1 mg，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇3 mL超声溶解，再加甲醇定容刻度，即得质量浓度分别为0.11、0.1 mg·mL-1的五味子醇甲与五味子酯甲对照品储备液。

2.2.2 样品溶液制备 取五味子原药材适量，经烘干粉碎，过三号筛，取粉末3 g，精密称定，置250 mL具塞三角瓶中，加pH值为5的溶剂36 mL(水溶液以盐酸调至pH=5)，浸泡2 h，水浴加热提取，水浴温度70 ℃，提取5次，每次1 h。将5次所得提取液置于烧杯中，并将烧杯置于60 ℃的水浴锅加热浓缩，当烧杯内液体少于100 mL时转移至100 mL蒸发皿内继续加热，待溶剂蒸干后，再用水-乙腈(90∶10)溶液,边洗涤边转移至50 mL容量瓶中，直至将蒸发皿内残渣完全洗净，最后用水-乙腈(90∶10)溶液定容至刻度，摇匀，将提取液离心5 min (5000 r·min-1)，取上清液即得。0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 分析条件 色谱柱：Waters SunfireTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A相为水，B相为乙腈，梯度洗脱，梯度洗脱程序：0～10 min：10%～90%B，10～13 min：90%B，13～15 min：90%～10%B；流速为0.8 mL·min-1；柱温为25 ℃；进样量为5 μL。

质谱采用ESI正离子模式进行扫描，监测模式为多反应监测模式(MRM)。离子化参数：离子喷雾电压5 500 v；雾化气，辅助气为氮气，离子源喷雾温度为650 ℃；辅助喷雾温度为60 ℃，质谱多反应监测参数见表6。

表6 五味子醇甲和五味子酯甲多反应监测参数

2.2.4 质谱参数的优化 将单个标准物质从标准储备液稀释为0.1 μg·mL-1的标准溶液，对每个化合物进行质谱参数的优化，包括母离子和子离子、去簇电压、入口电压、碰撞池出口电压、碰撞能量的确定。

在色谱条件和化合物质谱参数确定的情况下，不接色谱柱，将混合标准中间溶液稀释10倍，进行自动质谱离子化参数优化，优化参数有：喷雾电压、雾化气、辅助气、辅助气温度、气帘气，优化后测定样品的总离子流图，见图3。

注：A.对照品混合物；B.五味子水提物；1.五味子醇甲(11.27 min)；2.五味子酯甲(12.81 min)。图3 五味子提取物多反应监测模式(MRM)测定成分提取总离子流图

2.2.5 最低检测限最低定量限 采用信噪比法，测得五味子混合标准品的检测限(S/N=3)是5×10-5μg·mL-1，定量限(S/N=10)是1×10-4μg·mL-1。

2.2.6 标准曲线的绘制 取2.2.1项下对照品溶液五味子醇甲(0.11 mg·mL-1)和五味子酯甲(0.1 mg·mL-1)，将以上对照品溶液按梯度稀释(500%、400%、200%、150%、120%、100%、80%、60%、40%)，以五味子醇甲进样浓度0.24、0.32、0.39、0.49、0.62、0.8 μg·mL-1为横坐标X，以LC-MS/MS出峰的峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，得回归方程：Y= 7 400 000X+ 2 700 000，r=0.999 0。结果表明，五味子醇甲含量在0.24～0.8 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。以五味子酯甲进样浓度0.24、0.32、0.43、0.54、0.60、0.75、1.00 μg·mL-1为横坐标X，以LC-MS/MS出峰的峰面积为纵坐标Y绘制标准曲线，得回归方程：Y=16 000 000X+ 2 380 000，r=0.999 5。结果表明，五味子酯甲含量在0.24～0.1 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 方法学验证 参照《中华人民共和国药典》2015版一部对五味子药材质量控制方法的现行规定，对优化结果进行方法学验证(精密度、重复性和样品稳定性)。

2.2.8 精密度试验 选取2.2.6项中对照品溶液浓度梯度中的(80%、100%、120%)3个浓度的溶液，按上述色谱条件连续进样3次，进行测定。结果3个浓度下峰面积RSD分别为：五味子醇甲0.75%～3.49%；五味子酯甲3.26%～4.59%。

2.2.9 重复性试验 取五味子原药材适量，按照2.2.2项样品溶液的制备方法，制备6组，分别测定，每次进样5 μL，连续进样5次测定峰面积，根据标准曲线方程计算五味子醇甲的RSD为1.64%，五味子酯甲的RSD为1.92%。

2.2.10 稳定性试验 取五味子原药材适量，按照2.2.2项样品溶液的制备方法，制备1组，0、2、4、8、12、24 h进样5 μL，测定峰面积，在0、2、4、8、12 h测得的峰面积相对稳定。根据标准曲线方程计算五味子醇甲的RSD为2.02%，五味子酯甲的RSD为1.04%。结果表明，样品在12 h内稳定,在12～24 h内含量有显著下降。

2.2.11 加样回收试验 精密吸取已知含量的提取液样品0.5 mL，共6份，分别精密加入五味子醇甲及五味子酯甲对照品溶液，选取2.2.6项中对照品溶液浓度梯度中的(80%、100%、120%)3个浓度的溶液各0.5 mL，超声混匀，吸取5 μL，注入色谱仪，测定。五味子醇甲的平均回收率为96.05%，RSD为3.06%；五味子酯甲的平均回收率96.41%，RSD为3.72%。

2.2.12 含量测定 取五味子原药材适量，按照2.2.2项样品溶液的制备方法，制备3组，分别测定，每次进样10 μL，测定峰面积，根据标准曲线方程计算五味子醇甲的平均含量为0.22%，五味子酯甲的平均含量为0.02%。

3 讨论

3.1 PB-CCD

Plackett-Burman实验设计是常用的优选主要影响因素方法，效应面法(CCD)是近年来国外医药工作者常用的实验设计和优化法，通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面上选择较佳的效应区，从而确定自变量取值范围,即最佳实验条件。

3.2 溶剂与流动相

在梯度洗脱中由于甲醇和分析物间氢键的相互作用，可能引入额外的共振结构，并有可能引起拖尾峰。因此，选择乙腈作为有机相。另外，溶剂pH值也是影响五味子中有效成分溶出的重要参数，在PB设计结果的基础上一确定其数值为pH为5.0。对照品选用甲醇溶解。

4 结论

五味子药理作用广泛，临床用于治疗肝炎、神经衰弱等疾病，疗效显著，是一种很有开发价值的中药材。我国富产五味子，且其药用历史悠久，具有广阔的应用前景。随着五味子化学成分和药理活性的深入研究，对五味子的深加工提取工艺就有了更高的要求。由于水提工艺操作要求低、成本低，符合工业化大生产的要求。因此采用PB-CCD方法对五味子水提工艺进行优化，不但为五味子的质量控制提供依据，也能推动五味子的市场开发和利用。

[1] 李林福，张赛男，刘海清，等.五味子炮制研究进展[J].中国实验方剂学杂志.2015，21(03)：232-234.

[2] 窦志华，罗琳，安莉萍，等.五味子血清药化学初步研究[J].中药材.2013，36(07)：1146-1148.

[3] 刘璇，李正，华声瑜，等.生脉注射液抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的药理学研究[J].中成药.2015，37(02)：251-255.

[4] 周萍，官江，何先元，等.益肾固本汤联合针灸治疗慢性肾炎[J].中成药.2015，37(09)：1906-1909.

[5] 高家荣，季文博，姜辉，等.酸枣仁-五味子药对醇水双提物对PCPA致失眠大鼠氨基酸类神经递质的影响[J].中药材，2013，36(10)：1635-1639.

[6] 徐月，高慧，贾天柱.五味子“生熟异用”之降血糖作用[J].中药材，2014，37(11)：1977-1979.

[7] 肖飞，翁文，罗焕敏.五味子醇甲对β-淀粉样蛋白损伤PC12细胞的预保护及治疗作用[J].中药材.2010，33(03)：397-401.

[8] 李颖，纪莎，高锦娟，等.星点设计-效应面法优化复方巴戟天生骨颗粒提取工艺[J].中药材.2014，37(10)：1863-1867.

[9] 宋川霞，陈红梅，戴宇，等.Plackett-Burman试验设计联用星点设计-效应面法优化纤维素酶水解淫羊藿苷为宝藿苷Ⅰ的工艺[J].中药材.2014，37(11)：2082-2086.

ApplicationofPlackett-Burman-CentralCompositeDesignforExtractProcessingofSchisandrachinensisbyHPLC-MS/MS

WANGMei1，LIUMingming2，LIANGChenguang2，SHIXinbo2，BAIHongbo2,SONGZhongxing2，LIUYanru2，TANGZhishu2*

(1.TheAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine，Shaanxi，Xianyang712000，China；2.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Xianyang712083，Shaanxi，China)

Objective：A Plackett-Burman-Central Composite Design with response surface analysis method was applied to optimize the aqueous extraction efficiency ofSchisandrachinensismaterials.Method：By using design of experiments (DOEs)，the controllable factors of PB-CCD experiment were selected for further optimization，such as immersion time，liquid/solid ratio，pH value，extraction time，temperature and concentration based on schisandrin and schisantherin A determination.Results：An optimized condition of extraction was selected，2 hours of immersion time，1 hour of extraction time，70 ℃ of extraction temperature with five times under pH 5.0 of solvent and 60 ℃ of concentration temperature.Conclusion：The strategy of optimization method based on PB-CCD experiment design can apply a simple and reliable pathway for the aqueous extraction ofS.chinensis.

PB-CCD design；HPLC-MS/MS；Schisandrachinensis；schisandrin；schisantherin A

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.020

2015-12-10)

国家自然科学基金项目(81501229)；陕西省协同创新计划项目(2015XT-35)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(2011KTCL03-05)

*

唐志书，教授，研究方向：中药新药及新剂型开发；Tel：(029)38185060，Email：tzs6565@163.com