响应曲面法优化金花葵种子中黄酮的提取工艺△

王璐珊，吴士龙，王淼，李先哲，王达，吴兆华，高慧媛*

(1.沈阳药科大学 教育部基于靶点的药物设计与研究重点实验室，辽宁 沈阳 110016；2.牡丹江医学院 药学院，黑龙江 牡丹江 157011)

响应曲面法优化金花葵种子中黄酮的提取工艺△

王璐珊1，吴士龙1，王淼2，李先哲1，王达1，吴兆华2，高慧媛1*

(1.沈阳药科大学 教育部基于靶点的药物设计与研究重点实验室，辽宁 沈阳110016；2.牡丹江医学院 药学院，黑龙江 牡丹江157011)

目的：优化金花葵种子中黄酮的提取工艺。方法：在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、提取时间及料液比为自变量，采用响应曲面法研究各因素及其交互作用对金花葵种子中黄酮提取的影响。模拟得出了黄酮提取的回归方程，确定黄酮提取的最佳条件。结果：优化得到的最佳工艺参数为乙醇浓度60%；提取温度为80℃；提取时间为60min；液料比为1∶39；提取1次。结论：该提取工艺稳定、合理、预测性良好。

金花葵；黄酮；响应曲面；乙醇提取；紫外分光光度法

金花葵又名菜芙蓉，也称野芙蓉，为一年生草本锦葵科秋葵属植物。金花葵的花、叶、种子药食兼用，营养及开发价值较高[1]。金花葵全株总黄酮含量较高，是其主要的生物活性物质[2-3]。现代医学研究表明，该植物的总黄酮有抗炎镇痛、改善心脑血管微循环及抗疲劳、治疗口腔溃疡、降脂等作用[4-5]。黄酮作为天然植物雌激素，对于人类的健康有重要作用，如在延长女性青春期、减轻或避免中老年更年期综合征等方面有很大的功能，其药用价值已被世界各国医药、食品行业广泛重视[6]。金花葵种子除活性黄酮外，还有不饱和脂肪酸、维生素E、多种微量元素等。

1 仪器与材料

1.1仪器

AB135-S型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；UV-1700型紫外分光光度计[岛津国际贸易(上海)有限公司]；R-1001N型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2试药

芦丁对照品(自制，含量≥98%)；石油醚(天津市富宇精细化工有限公司)；乙醇(分析醇，天津市富宇精细化工有限公司)；超纯水；氢氧化钠、硝酸铝(天津博迪化工股份有限公司)；亚硝酸钠(天津市永大化学试剂有限公司)。

1.3材料

干燥的金花葵种子收于黑龙江省牡丹江市东宁县金花葵种植园，由沈阳药科大学袁久志副教授鉴定为金花葵(Ablemoschusmanihot)的种子，

2 方法

2.1检测波长的选择

供试品、对照品溶液采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，对总黄酮进行含量测定，在400～900nm进行全波长扫描，在510nm处有最大吸收，见图1。

注：A.供试品；B.对照品。图1 供试品与对照品的紫外扫描图

2.2供试品溶液的制备

精密称取经粉碎、石油醚脱脂(脱脂两次，每次3min)干燥的金花葵种子1.5g至圆底烧瓶中，按照试验设计要求进行水浴回流提取，趁热抽滤提取液，残渣用60%乙醇洗涤两次，合并滤液及洗涤液，减压浓缩，提取物用60%乙醇溶解并定容至25mL容瓶中，摇匀，制成供试品溶液，备用。

2.3对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品6mg，置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.24mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

2.4标准曲线的制定

分别精密量取上述对照品2、3、5、10mL于25mL容量瓶中，加5%的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置5min后加10%硝酸铝1mL，摇匀，静置5min，加10%氢氧化钠10mL，加60%乙醇稀释到刻度，摇匀，静置15min，以相应试剂为空白，在510nm处测定吸光度[7]。对吸光度值和标准品浓度进行分析，得线性回归方程。

2.5重复性试验

取同一金花葵种子样品6份，按2.2项下方法制备，测定黄酮含量，样品中黄酮的平均质量分数为4.1mg·g-1，RSD为1.1%，表明方法重复性良好。

2.6精密度试验

取同一对照品溶液6份，按2.4项下方法测定吸光度，吸光度值分别为0.288、0.285、0.282、0.286 、0.283、0.287，RSD为0.94%，表明仪器精密度良好。

2.7加样回收率试验

分别精密称取3份已知含量的种子0.7495、0.7504、0.7492g，分别加入芦丁对照品2.5mg，按2.2项下方法制备供试液，按2.4项下方法测定吸光度，结果见表1。

表1 金花葵种子的加样回收率试验结果(n=3)

2.8单因素试验

选择液料比、提取时间、乙醇浓度、提取次数、提取温度这5个因素作为黄酮提取工艺有影响的参数，进行单因素试验。

2.8.1料液比对提取率的影响 在提取温度为80℃、提取时间为60min、乙醇浓度为60%、提取次数为1次的条件下，考察料液比对金花葵种子中黄酮含量的影响，分别选取料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50进行提取。

2.8.2提取时间对提取率的影响 在提取温度为80℃、料液比为1∶40、乙醇浓度为60%、提取次数为1次的条件下，为了考察提取时间对金花葵种子中黄酮含量的影响，分别选取提取时间40、60、90、100、120min进行提取。

2.8.3乙醇浓度对提取率的影响 在提取温度为80℃、提取时间为60min、料液比为1∶40、提取次数为1次的条件下，考察乙醇浓度对金花葵种子中黄酮含量的影响，分别选取50%、60%、70%、80%的乙醇浓度进行提取。

2.8.4提取次数对提取率的影响 在提取温度为80℃、提取时间为60min、料液比为1∶40的条件下，考察提取次数对金花葵种子中黄酮含量的影响。

2.8.5提取温度对提取率的影响 在提取时间为60min、料液比为1∶40、乙醇浓度为60%、提取次数为1次的条件下，考察提取温度对金花葵种子提取物中黄酮含量的影响，分别选取50、60、70、80、90℃进行提取。

2.9响应曲面法设计

在单因素试验结果基础上，采用软件Design-Expert.8.05b，根据Box-Behnken中心组合设计原理设计自变量，以金花葵种子中总黄酮含量为响应值，通过响应曲面分析对金花葵种子中黄酮提取工艺进行优化[8-10]。

3 结果与分析

3.1标准曲线方程

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得芦丁的标准曲线回归方程：Y=12.659X+0.0036(r=0.9993)。结果表明，芦丁对照溶液浓度在0.019～0.096mg·mL-1线性关系良好。

3.2单因素试验结果

3.2.1料液比对提取率的影响 随着料液比的扩大，黄酮的含量不断升高，当料液比从1∶20扩大至1∶40时，黄酮的含量增加趋势显著，之后增幅较小。这是由于料液比的增大可以增加物料与溶剂的接触面积，使黄酮更充分的溶解出来，但当继续增加料液比时，由于黄酮的含量逐渐达到平衡，此时黄酮含量增长缓慢。见图2。

图2 料液比对金花葵种子提取物中黄酮含量的影响

3.2.2提取时间对提取率的影响 随着时间的增加黄酮的含量不断升高，当时间为60min时黄酮的含量达到了最大值，随着时间的继续增加，黄酮的含量呈下降状态。这表明目的产物浸出过程与时间密切相关，时间过短产物溶解不充分，但时间过长又会引起产物结构的变化进而使含量降低。见图3。

图3 提取时间对金花葵种子提取物中黄酮含量的影响

3.2.3乙醇浓度对提取率的影响 随着乙醇浓度的增加黄酮的含量不断升高，当浓度达到60%时，黄酮的含量达到了最高值，随着乙醇浓度的继续增加黄酮的含量又逐渐降低。推测原因可能是当溶质达到一定比例时，黄酮在乙醇中的溶解达到平衡，再增加溶质的量，就会增加杂质的溶出，使金花葵种子提取物中黄酮的含量下降。见图4。

图4 乙醇浓度对金花葵种子提取物中黄酮含量的影响

图5 提取次数对金花葵种子提取物中黄酮含量的影响

3.2.4提取次数对提取率的影响 金花葵种子中总黄酮有效成分一次提取就已取得最大提取量，目标产物大部分被提出，第二、三次提取无太大意义。见图5。3.2.5提取温度对提取率的影响 随着提取温度的升高，黄酮的含量有增高趋势，80℃时达到最大，随着提取温度的继续升高，黄酮的含量呈缓慢下降状态。推测原因是过高的温度对黄酮会结构造成一定程度的破坏，故而以80℃为最佳提取温度。见图6。

图6 提取温度对金花葵种子提取物中黄酮含量的影响

3.3提取工艺的响应曲面优化

通过单因素试验发现，上述5个参数对金花葵种子中黄酮提取效果均有不同程度的影响，但乙醇浓度、提取时间、料液比对黄酮提取效果影响较大，而提取温度对黄酮提取效果影响较小。通过响应曲面法对影响黄酮提取效果较大的3个因素乙醇浓度、提取时间、料液比进行优化，以黄酮含量为响应值，设计了三因素三水平的试验方案。

采用Box-BehnkenDesign(BBD)设计三因素三水平共17组试验，以黄酮的含量(Y)为响应值，经回归拟合后，各因素与响应值的回归方程为：Y=0.41-0.032A-0.020B+0.015C+0.045A2+0.035B+0.015C2。试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表2 提取工艺条件BBD方案设计及试验结果

表3 方差分析结果

由方差分析可知，该回归模型P<0.000 1，表明回归方程模型极其显著；失拟项P= 0.751 0>0.05，表明失拟不显著，从而说明该模型能够对金花葵种子中黄酮的提取进行准确地预测和分析。从回归方程系数显著性检验可知：一次项A(乙醇浓度)、B(提取时间)和C(料液比)极其显著；二项式A2、B2和C2极其显著；交互项BC具有一定的显著性，AB和AC不显著。说明不同的提取工艺对金花葵种子中黄酮提取量的影响不是简单的线性关系。

根据所拟合的回归方程，作相应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，分析乙醇浓度、料液比、提取时间对金花葵种子中黄酮含量的影响。见图7～9。

图7 提取时间与料液比的等高线图和3D响应曲面图

以上三组图直观地反应了各因素对响应值的交互影响，乙醇浓度和料液比的相互作用较显著。等高线的形状可反应出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则相反。

采用Design-Expert.8.05b软件的响应优化功能对试验结果进行优化，得到最优条件：乙醇浓度为60.32%；提取时间为60.43 min；液料比为1∶39.50，预测金花葵种子中黄酮的质量分数为 5.5 mg·g-1。

图8 乙醇浓度和提取时间的等高线图和3D响应曲面图

图9 料液比与乙醇浓度的等高线图和3D响应曲面图

3.4最优工艺的优化

对响应曲面法所得到的最优条件进行验证，检验得到的结果是否真实可靠，在最佳提取条件下分别提取了3次，结果见表4。

表4 最优条件的验证

由表三可知，黄酮的平均质量分数为5.47 mg·g-1，与模型预测值5.5 mg·g-1偏差不大，吻合较好，说明该预测模型能够可靠的预测黄酮的含量 。

4 讨论

基于试验设计软件Design-Expert.8.05b，通过二次回归设计得到了黄酮含量与乙醇浓度、料液比和提取时间关系的回归模型，经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好地预测黄酮含量。利用模型的响应面及其等高线，对影响黄酮提取量的关键因素及其相互作用进行探讨，得到最优工艺：乙醇浓度为60%；提取温度为80℃；提取时间为60min；料液比为1∶39；提取次数为1次。在最优提取工艺的条件下，金花葵种子提取物中黄酮含量分别为5.5mg·g-1。因此，利用响应曲面分析方法对金花葵种子中黄酮提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，能有效减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的试验研究奠定基础，为金花葵的开发利用提供依据。

[1] 彭志兵，吴正平.高效液相色谱—质谱法分析金花葵花中金丝桃苷[J].安徽农业科学，2008，36(23)：10028-10029.

[2] 仇燕.菜芙蓉花中总黄酮微波提取的研究[J].中药材，2006，29(4)：387-390.

[3] 卢丹，贾瑞波.中药金花葵的研究进展[J].中国药物评价，2015，32(2)：90-92.

[4] 陈艳芬，江涛，唐春萍，等.高良姜总黄酮抗炎镇痛作用的实验研究[J].广东药学院学报，2009，25(2)：188-191.

[5] 杨秀松.金花葵粗黄酮提取物的免疫调节作用研究[J].中国药师，2013，16(9)：1307-1310.

[6] 危晴，兰蓉，辛秀兰，等.紫外分光光度法测定金花葵籽中总黄酮的含量[J].安徽农业科学，2012，(12)：7050-7060.

[7] 罗晓梅，张吟，黄丹丹，等.紫外可见分光光度法测定无花果叶提取物中总黄酮的含量[J].中国药房，2015，26(15)：2111-2113.

[8] 李晓军，潘宏利，陈花，等.响应曲面法优化超声辅助提取金银花总黄酮[J].陕西师范大学学报(自然科学版)，2009，37(2)：81-90.

[9] 李光，李学兰，孙慧峰，等.响应曲面法优化铁石斛多糖提取条件[J].中国现代中药，2011，13(9)：29-33.

[10] 吴士龙，李敏，李小玢，等.响应曲面法优化树莓叶中鞣花酸的提取工艺[J].中国新药杂志，2014，23(6)：692-697.

OptimizationofExtractionParametersofFlavonoidsfromAblemoschusmanihotUsingResponseSurfaceMethodology

WANGLushan1，WUShilong1，WANGMiao2，LIXianzhe1，WANGDa1，WUZhaohua2，GAOHuiyuan1*

(1.KeyLaboratoryofStructure-BasedDrugDesign&DiscoveryofMinistryofEducation，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China；2.DepartmentofPharmacology，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China)

Objective：To optimize the process of extracting flavonoids from the seeds ofAblemoschusmanihot.Methods：Ethanol concentration，extraction time and liquid ratio were selected as independent variables of response surface methodology to study the effects of various factors and their interactions on extraction of flavonoids from the seeds ofA.manihot.The extraction regression equation for flavonoids was obtained by simulation and the optimum extraction conditions of flavonoids were determined.Results：The optimal extraction parameters were as follows：ethanol concentration60%,extraction temperature80℃,extraction time60min，liquid ratio1∶39.Conclusion：The extraction technology is reliable，reasonable and highly predictive．

Ablemoschusmanihot;flavonoid;response surface;alcohol extracting;ultraviolet spectroscopy

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.023

2015-09-22)

沈阳药科大学药物化学学科建设研究资助计划，校级优秀中青年教师资助计划A类(2015013)

*

高慧媛，教授，博士生导师，研究方向：中药、天然药物活性成分研究；Tel：(024)23986481，E-mail：sypugaohy@163.com