DNA条形码在中药破壁饮片物种鉴定的应用

郑夏生，赖智填，成金乐

(国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室 中山市中智药业集团有限公司，广东 中山 528437)

DNA条形码在中药破壁饮片物种鉴定的应用

郑夏生，赖智填，成金乐*

(国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室 中山市中智药业集团有限公司，广东 中山528437)

目的：建立中药破壁饮片的DNA条形码鉴定方法。方法：通过提取15个品种的中药破壁饮片的基因组DNA，并利用DNA条形码鉴定技术中的ITS2和psbA-trnH两个片段进行物种鉴定。结果：ITS2可以成功地对这15个品种进行鉴定；psbA-trnH也可对大部分的样品进行鉴定。结论：说明DNA条形码技术在中药破壁饮片的物种鉴定上可以得到很好的应用；同时也验证了以ITS2为主，psbA-trnH为辅助的药用植物DNA条形码鉴定思路的正确性和可行性。另外，psbA-trnH的数据库也可能存在不足，需补充完善更全面的物种序列信息，以供日后的物种鉴定提供更全面的基因模板信息作为参考和对照。

破壁饮片；物种鉴定；DNA条形码；ITS2；psbA-trnH

中药破壁饮片是通过现代粉碎技术将传统中药饮片加工至D90< 45 μm(300目以上)的破壁粉末，进而通过无固体添加成型技术制成的30～100目的干燥颗粒状饮片[1]。药材经过细胞破壁处理后，其中所含的有效物质获得更好的溶出[2-3]，加上生产过程中无高温提取，可以有效避免有效物质的变性。但与此同时，破壁后的药材失去了绝大多数的显微特征，增加了其物种鉴定的难度。DNA条形码为中药破壁饮片的物种鉴定提供了很好的解决方案。

DNA条形码是近年来发展迅速的可用于动植物物种快速鉴定的技术[4]。该技术系通过基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定，具有快速、准确、重复性高等优点[5-8]。陈士林课题组对6000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选，提出以ITS2(Internal Transcribed Spacer 2)作为药用植物标准DNA条形码[9]，以psbA-trnH作为辅助的药用植物鉴定技术的思路[10]；并创建了“中草药DNA条形码生物鉴定体系”，实现中药资源信息检索、查询以及基因序列的比对鉴定，从基因水平解决中药材与混伪品的物种识别问题。他们还将DNA条形码技术应用于中药材流通监管领域，建立中药材二维DNA条形码流通监管体系[11]，进而为中药材流通监管提供更有力的技术支持。

近年来，DNA条形码技术在中药基原植物和中药材的物种鉴定上得到了广泛的应用。然而，该技术尚未在中药产业中得到实际应用。《中华人民共和国药典》(2010年版第三增补版)收录了DNA条形码技术，作为中药材质量控制的新方法[12]。因此，DNA条形码在中药产业化中的实际应用将成为未来若干年发展的潮流。本研究报道了利用DNA条形码对15个品种的中药破壁饮片进行物种鉴定的工作，是DNA条形码在中药产业化应用的重要探索。

1 仪器与材料

1.1仪器

生物均质仪(爱施德，Bioprep-24)；低温冰箱(Eppendorf，5430R)；多功能PCR仪(Biometra，FlexCycler 2)；水平电泳仪(Bio-Rad)；凝胶成像仪(Biometra，BDAdigital)。

1.2材料

本研究中使用的中药破壁饮片均由中山市中智药业集团有限公司提供,共涉及15个中药品种，详细信息见表1、图1。

表1 15个破壁饮片品种样品信息

注：样品序号同表1。图1 15个品种的中药破壁饮片

各品种中药破壁饮片的原料药材经过中山市中智药业集团有限公司贾世清中药师鉴定，凭证标本保留于国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室留样室。

植物基因组DNA提取试剂盒(百泰克，DP3111)；2×Power Taq PCR MasterMix(百泰克，PR1701)。

2 方法

2.1DNA提取和PCR扩增

分别称取各类中药破壁饮片50 mg，置于2.0 mL离心管中，加入2颗Φ 5 mm的灭菌钢珠，用生物均质仪(爱施德，Bioprep-24)以5.0 m·s-1震荡30 s，重复震荡2次，中间停顿30 s。DNA提取按照植物基因组DNA提取试剂盒(百泰克，DP3111)说明书进行。以所得的DNA作为模板建立PCR体系：2×Power Taq PCR MasterMix(百泰克，PR1701)12.5 μL，正反向引物(ITS2引物：ITS2_2F,ATGCGATACTTGGTGTGAAT;ITS2_3R,GACGCTTCTCCAGACTACAAT。psbA-trnH引物：psbA_F，GTTATGCATGAACGTAATGCTC；trnH_R，CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O补足体积至25.0 μL。温度程序(ITS2)：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，52 ℃，30 s，72 ℃，45 s，35个循环；72 ℃，5 min。温度程序(psbA-trnH)：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72 ℃，50 s，35个循环；72 ℃，5 min。

反应完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，在目的区域出现清晰条带的样品则送样测序。

2.2数据处理

将测序所得的原始峰图导入CodonCode Aligner(Version 5.1.5.0)，拼接后去除低质量区和引物区，并采用基于隐马尔科夫模型的HMMer注释方法分别去除5.8S rRNA和28S rRNA区以获得ITS2序列；psbA-trnH片段则仅进行引物区域裁切。将各样品的ITS2序列和psbA-trnH序列作为Quary分别在NCBI上进行序列比对；在中药材DNA条形码鉴定系统(http：//www.tcmbarcode.cn/china/index.php?optionid=174)上做比对，取同源性最高的比对结果。

3 结果与分析

15个品种的中药破壁饮片均能成功提取出基因组DNA，并可成功获得ITS2片段(见图2)；其中有13个品种可以扩增得到psbA-trnH片段(见图3)。

图2 15个品种的中药破壁饮片的ITS2片段PCR扩增结果

图3 15个品种的中药破壁饮片的psbA-trnH片段PCR扩增结果

3.1ITS2鉴定结果

各样品的ITS2序列比对结果见表2。利用ITS2片段可以成功鉴定出本研究的15个品种的中药破壁饮片。决明子的ITS2序列中202位点为A-G变异；玫瑰花ITS2序列中20位点为C-A变异；其余各样品的ITS2序列均与公共数据库中已有序列的同源性达到100%。实验结果表明ITS2可以用于本研究的15个品种的中药破壁饮片的物种鉴定。

表2 15种中药破壁饮片的ITS2序列比对结果

3.2psbA-trnH鉴定结果

本研究的15个品种的中药破壁饮片中，红参与玫瑰花均无法扩增得到psbA-trnH片段；另外13个品种的psbA-trnH序列比对结果见表3。北沙参的psbA-trnH序列比对结果为伞形科植物白芷Angelicadahurica(同源性99.5%)；但目前尚未有关于北沙参psbA-trnH的鉴别报道，且NCBI数据库中尚未有关于北沙参原植物珊瑚菜Glehnialittoralis的psbA-trnH序列信息。因此，本研究获得的序列应为北沙参原植物珊瑚菜G.littoralis的psbA-trnH序列，但与白芷的psbA-trnH序列相似度接近100%，无法相互区别，说明psbA-trnH不适合用于北沙参及其混伪品的鉴定。罗布麻叶的psbA-trnH序列比对结果为同属植物Apocynumandrosaemifolium(分布于北美洲)，目前亦未有罗布麻叶的psbA-trnH鉴定报道，NCBI数据库中尚未有关于罗布麻A.venetum的psbA-trnH序列信息。因此，本研究获得的序列应为罗布麻A.venetum的psbA-trnH序列。另外，三七的psbA-trnH序列在中药材DNA条形码鉴定系统比对结果为羽叶三七Panaxjaponicasvar.bipinnatifidus(同源性97.3%)；而在NCBI的比对结果则为三七P.notoginseng(同源性100%)，说明中药材DNA条形码鉴定系统中可能没有三七的psbA-trnH序列。

表3 13种中药破壁饮片的psbA-trnH序列比对结果

4 讨论

本研究的15个品种中药破壁饮片均可利用ITS2进行物种鉴定；而psbA-trnH则有部分品种不适用的情况。这说明了ITS2作为通用性较好的主要DNA条形码，对于本研究的这些大宗常用药材的鉴定可行性很高。

许多中药材的炮制过程涉及高温处理。而高温处理常常会造成DNA的进一步降解，进而影响DNA条形码鉴定的实验成功率。本研究的实验材料中，有部分品种的炮制过程包含了高温处理，如北沙参需用沸水烫，当归和菊花经过烘干，而红参需蒸透。但是从实验结果看，这些品种的ITS2鉴别并不存在问题。因此，高温处理对于DNA鉴别是否造成必然影响，需视具体情况而定。

中药破壁饮片是一类创新型的中药饮片。药材的细胞壁被打破后，使得药材失去细胞和组织特征；但却在另外三个方面获得优势：1)增加有效物质的溶出；2)提高药材的均匀性；3)有利于DNA的提取。近年来，越来越多的药理药效学研究结果表明中药破壁饮片相对于传统饮片具有更好的安全性和有效性[13-16]。本文的研究则是从质量控制方面做出一次有意义的探索——利用DNA条形码技术进行中药破壁饮片的物种鉴定，进一步为中药破壁饮片的临床安全使用提供有力的保障。

中药材的DNA条形码鉴别是一项非常有意义的技术，本研究是DNA条形码在中药破壁饮片物种鉴定中的初步应用探索。DNA条形码在中药产业化的普及应用前，尽可能多地完善中药材不同DNA条形码片段的序列信息，是一项不可避免且亟待解决的问题。

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ApplicationofDNABarcodingTechnologyinSpeciesIdentificationofUltrafineGranularPowderofHerbalMedicine

ZHENGXiasheng，LAIZhitian，CHENGJinle*

(TheKeyLaboratoryofTechnologyofBreakingCellWallandApplicationinChineseMedicineDecoctionPieces，ZhongshanZhongzhiPharmaceuticalGroup，Zhongshan528437，China)

Objective：To establish a species identification method for Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine by DNA barcode.Methods：The genome DNA of15different kinds of Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine were extracted，and then applied to species identification by DNA barcode with two DNA fragments，ITS2andpsbA-trnH.Results：ITS2could successfully identify all the15samples，whilepsbA-trnHfailed to identify several samples.Conclusion：The results indicate that the technology of DNA barcoding is suitable for species identification of Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine.In addition，the strategy of identifying species using ITS2fragment，with thepsbA-trnHfragment as a supplement，was proved to be correct and feasible.Moreover，sequences information ofpsbA-trnHfragments of the datasets might be insufficient.It needs to be supplemented with more species sequences，so as to provide more comprehensive references for species identification work.

Ultrafine Granular Powder of Herbal Medicine；species identification;DNA Barcoding;ITS2;psbA-trnH

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.010

2015-09-25)

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成金乐，教授，研究方向：创新中药研究与开发；Tel：(0760)85312928，E-mail：gdcjl9@126.com