HPLC-ELSD测定川楝子中川楝素含量

孟杰，朱文俊，王礼均*，黄国杰，宁鹤，文永盛

(1.四川省中药饮片有限责任公司，四川 成都 611730；2.成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610000)

·基础研究·

HPLC-ELSD测定川楝子中川楝素含量

孟杰1，朱文俊1，王礼均1*，黄国杰1，宁鹤1，文永盛2

(1.四川省中药饮片有限责任公司，四川 成都 611730；2.成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610000)

目的：对比HPLC-MS，采用HPLC-ELSD建立适宜于川楝子中川楝素测定的新方法。方法：采用HPLC-ELSD，色谱柱：Agilent Eclipse XDS-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.01%甲酸溶液(3l∶69)，流量：1.0 mL·min-1，柱温：35 ℃，检测器漂移管温度：95 ℃，气体流速：2.8 L·min-1，测定了12批不同产地川楝子中川楝素的含量。同时采用HPLC-MS法，仪器为岛津LCMS-8040，色谱柱为InertSustainTMC18(50 mm×2.1 mm，2 μm)，分析条件照《中华人民共和国药典》2010年版一部“高效液相色谱-质谱法”(附录Ⅵ D和附录Ⅸ J)，测定12批不同产地川楝子中川楝素的含量。结果：在本研究HPLC-ELSD法条件下，川楝素在3.78～47.25 μg线性关系良好(r=0.999 1)，平均回收率为99.43%，RSD=1.44%(n=9)，对比HPLC-MS法测定结果，方差分析显示两测定方法结果差异无统计学意义。结论：本研究首次建立了HPLC-ELSD测定川楝子中川楝素含量的方法，该方法快速、准确，适用于川楝子中川楝素的含量测定。

高效液相；蒸发光；质谱；川楝子；川楝素

川楝子，又称金铃子，为楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc的干燥成熟果实，具有疏肝泄热、行气止痛、杀虫的功能，用于治疗肝郁化火，胸胁、脘腹胀痛，疝气疼痛，虫积腹痛[1]。川楝素(toosendanin，TSN)作为川楝子发挥药效的主要成分，广泛地存在于川楝子中，其含量高低也直接作为川楝子药材质量评价的重要指标。川楝素结构中具有半缩醛，始终有两个互变异构体存在，故定量时以川楝素两个峰面积之和计算[2-3]。有文献报道采用HPLC-UV法测定川楝子中川楝素的含量[4-6]，但实际情况下，川楝素紫外特征吸收为208 nm，接近末端吸收，此法容易受提取物中其他杂质干扰，且紫外检测器在低波长时基线容易产生漂移，所以《中华人民共和国药典》(《中国药典》)2010年版川楝子“含量测定”项下规定，川楝素的定量方法为高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)，该方法虽然灵敏、可靠，但是质谱仪操作较为复杂且价格昂贵，目前国内许多科研单位、企业还尚未配备[7-8]。蒸发光散射检测器(ELSD)为质量型检测器，其测定方法不依赖于样品的光学性质，适用于无紫外吸收的化学成分检测[9]。本研究采用高效液相结合蒸发光散色检测器对比高效液相-质谱法测定12批不同产地川楝子中川楝素含量，最终证明本研究所确立的HPLC-ELSD法代替HPLC-MS法测定川楝子中川楝素含量的方法可行。本研究建立了川楝子中川楝素含量的新测定方法，该方法快速、准确，适用于川楝子中川楝素的含量测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器

安捷伦1200高效液相色谱仪，Alltech ELSD 2000ES蒸发光检测器，岛津电子分析天平；岛津LCMS-8040超高效液质联用仪，包括LC-30AD×2(输液泵)，SIL-30AC(自动进样器)，CTO-30AC(柱温箱)，CBM-20A(系统控制器)，DGU-20A5(在线脱气机)，LCMS-8040(四极杆质谱仪)和LCMSsolution Ver.5.53(工作站)。

1.2 材料

川楝素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111842-201102)，12批川楝子药材购于成都国际商贸城中药材市场，经四川省中药饮片有限责任公司朱文俊主任中药师鉴定为楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc的果实。色谱纯乙腈；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 HPLC-ELSD法 Agilent Eclipse XDS-C18色谱柱(150 mm×4.6mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.01%甲酸溶液(3l∶69)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测器漂移管温度：95 ℃，气体流速：2.8 L·min-1。

2.1.2 HPLC-MS法 InertSustainTMC18色谱柱(50 mm×2.1 mm，2 μm)，流动相：乙腈-0.01%甲酸溶液(31∶69)，流速：0.35 mL·min-1，柱温：35 ℃，进样体积：1 μL，分析时间：8 min。离子源为ESI正离子模式，离子源电压：4.5 kV，雾化气为氮气(3 L·min-1)，干燥气为氮气(15 L·min-1)，检测器电压为2.04 kV，扫描模式为SIM(选择离子监测模式，m/z573)，驻留时间为20 ms，脱溶剂管温度为200 ℃，加热模块温度为400 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

取川楝素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1.89 mg川楝素的溶液，供HPLC-ELSD法测定用；同时吸取1 mL置500 mL容量瓶，加甲醇定容后得到3.78 μg·mL-1的溶液，供HPLC-MS法测定用。

2.3 供试品溶液的制备

取本品中粉约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流 1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，供HPLC-ELSD法测定。同时吸取1 mL续滤液置10 mL容量瓶中，加甲醇定容后供HPLC-MS法测定。

2.4 HPLC-ELSD法方法学考察与结果

2.4.1 系统适用性考察 对比《中国药典》2010年版一部“川楝子”项下所规定的HPLC-MS法测定川楝素含量，本实验新确立的HPLC-ELSD分析系统，采用川楝素对照品按2.1项优化条件对川楝子中色谱峰进行了指认。结果表明，川楝素存在互变异构色谱峰；在该分析条件下，两互变异构体之间分离度大于1.5，完全满足分析要求，HPLC-ELSD色谱图见图1，HPLC-MS色谱图见图2。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取2.2项下对照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以峰面积对数值Y为纵坐标，进样量对数值X为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=5.634 3X-0.024 0，r=0.999 6。结果表明川楝素进样量在3.78～47.25 μg呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验 精密吸取1.89 mg·mL-1川楝素对照品溶液，在2.1项色谱条件下重复进样6次，计算得川楝素峰面积积分值的常用对数值的RSD=1.15%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取一份川楝素样品约2.5 g，按照2.3项下方法提取，并按照2.1项下色谱条件，在0、2、4、8、12、24 h分别测定1次，其峰面积的RSD=1.38%，表明在24 h内川楝素稳定。

2.4.5 重复性试验 同时精密称定6份川楝素样品，每份2.5 g，分别按照2.3项下方法提取，并按照2.1项下色谱条件测定，结果样品中川楝素平均含量是0.10%，RSD=2.01%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知川楝素含量的川楝子样品(川楝素质量分数为0.080%)9份，各约1.25 g，精密称定，分别精密加入一定量的川楝素对照品溶液，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进行测定，结果如表1所示。

表1 川楝子中川楝素加样回收率试验(n=9)

2.5 样品测定

取12批川楝子样品，3次重复，按照2.3项下方法提取，并按照2.1项下色谱条件分别测定并计算川楝素含量。HPLC-ELSD色谱图见图1，HPLC-MS色谱图见图2，测定结果见表2。

注：A.川楝素对照品；B.川楝子供试品(四川雅安)。图1 川楝子及对照品HPLC-ELSD图

注：A.川楝素对照品；B.川楝子供试品(四川雅安)。图2 川楝子SIM扫描色谱图(ESI-)

表2 不同产地川楝子中川楝素的测定(%)

根据表2可知，采用本文所建立的HPLC-ELSD法测定不同产地川楝子中川楝素含量，对比HPLC-MS法的测定结果，其误差百分比(APE)范围为0～3.16%，平均绝对百分比误差(MAPE)为1.70%，证明本研究所确立的HPLC-ELSD法代替HPLC-MS法测定川楝子中川楝素含量的方法可行。

进一步对比12批川楝子中川楝素含量，发现不同产地的川楝子中川楝素含量波动较大。依据《中国药典》2010年版一部对于川楝子中川楝素应为0.060%～0.20%的要求，本次测定的样品中，来自云南楚雄、思茅的川楝子含量低于要求，不能入药；而来自四川中江、雅安以及凉山的川楝子中川楝素含量均超过限量要求，不能直接入药，必须经过炮制处理将川楝素降低到规定范围方可使用。

3 讨论

3.1 方法适用性分析

由于川楝素紫外特征吸收为208 nm，接近末端吸收，若采用紫外检测器进行检测，容易受提取物中其他杂质干扰，且紫外检测器在低波长时基线容易产生漂移，因此采用HPLC-UV法进行川楝素含量测定的结果往往不够准确。采用本实验的HPLC-ELSD法进行分析，相比于《中国药典》2010年版一部“川楝子”项下所规定的HPLC-MS法，本法同样具有简便快速、结果准确、重现性好的特点，并且相对于质谱仪，蒸发光散射检测器具有价格低廉、操作简单的优点，适用于各科研、企业单位的配备。

3.2 川楝子资源开发

根据《中国药材产地生态适宜性区划》一书介绍，编者根据川楝子生态适宜性数值分析结果，并结合其生物学特性，并考虑自然条件、社会经济条件、药材主产地栽培和采收加工技术，建议选择引种栽培区域主要以四川、云南、贵州、湖南、湖北一带为宜[10]，本研究再次验证了四川产川楝子的质量较好的说法。但是川楝素具有一定的毒性，摄入过量可对胃肠道产生刺激作用，并且对肝脏有损害，所以《中国药典》2010年版限定其含量不得过0.20%。本研究中，来自四川中江、雅安以及凉山的川楝子中川楝素含量均超过相关限量要求，所以不能直接作为饮片“川楝子”入药。有文献报道通过炮制可以适当降低川楝素的含量[6]，因此，应通过诸如“清炒法”(《中国药典》2015年版通则0213)等相关炮制手段而使其饮片符合要求，从而达到充分利用川楝子资源的目的。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：39.

[2] 钟炽昌，谢晶曦，陈淑凤，等.川楝素的化学结构[J].化学学报，1975，33(1)：35-47.

[3] 舒国欣，梁晓天.关于川楝素化学结构的修正[J].化学学报，1980，38(2)：196-198.

[4] 陈强，周浓，王荣繁.HPLC测定川楝子不同采收期及不同部位中川楝素的含量[J].资源开发与市场，2012，28(9)：777-778，840.

[5] 刘红亚，崔红梅，周绚.RP-HPLC法测定川楝子药材中川楝素的含量[J].世界科学技术—中医药现代化，2008，10(3)：52-54.

[6] 周乐华，李迎春，窦志英.川楝子及其炮制品中川楝素含量测定研究[J].天津药学，2011，23(1)：20-22.

[7] 聂映，李志裕，姚卫峰.基于液相色谱飞行时间质谱的炒川楝子化学成分分析[J].安徽医药，2013，17(6)：943-945.

[8] 罗文汇，毕晓黎，孙冬梅.LC-MS法测定川楝子中川楝素[J].中成药，2014，36(7)：1556-1558.

[9] 赵宇新，李曼玲.蒸发光散射检测器在中药成分分析中的应用[J].中国中药杂志，2003，28(10)：913-917.

[10] 陈士林.中国药材产地生态适宜性区划[M].北京：科学出版社，2011：564-566.

DeterminationofToosendanininFructusToosendanbyHPLC-ELSD

MENGJie1，ZHUWenjun1，WANGLijun1*，HUANGGuojie1，NINGHe1，WENYongsheng2

(1.SichuanTraditionalChineseMedicineDecoctionPiecesco.，LTD.，Chengdu611730，China；2.Chengdufoodanddruginspectioninstitute，Chengdu610000，China)

Objective：To establish a new HPLC-ELSD method for determination of toosendanin in Fructus Toosendan comparing with HPLC-MS method.Methods：For HPLC-ELSD，an Agilent Eclipse XDS-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)was applied，the mobile phase consisted of methyl cyanide-0.01% methane acid(3l∶69)，the flow rate was 1.0 mL·min-1；the column temperature was 30 ℃；the drift tube temperature of ELSD was set at 95.0 ℃，and the flow rate of air was 2.8 L·min-1.At the same time，For HPLC-MS，a SHIMADZU LCMS-8040 was used for the verification of the new method，A InertSustainTMC18(50 mm×2.1 mm，2 μm)was applied，conditions according to the “Chinese Pharmacopoeia” in 2010 edition of “high performance liquid chromatography-mass spectrometry method”(Annex VI D and an appendix J)，12 batches of Fructus Toosendan were determined.Results：Under the conditions of HPLC-ELSD，we found that as for toosendanin，the linear detection range was 3.78-47.25 μg(r=0.999 1)，the average recovery was 99.43% and the relative standard deviation was 1.44%(n=9).And the results of the two quantification methods were identical.Conclusion：A HPLC-ELSD method for determination of toosendanin in Fructus Toosendan was established for the first time，and the method conforms to the method validation requirements，can be used for determination and analysis of toosendanin in Fructus Toosendan.

HPLC；ELSD；MS；Fructus Toosendan；toosendanin

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.011

2015-09-25)

*

王礼均，主管中药师，研究方向：中药炮制；E-mail：13060049032@163.com