改良线栓法制备SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型研究*

刘　波，李　菲，王丽娜，刘佳云（遵义医学院：.药理学教研室/基础药理教育部重点实验室；2.病理生理学教研室，贵州遵义563003）

·论著·

改良线栓法制备SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型研究*

刘波1，李菲1，王丽娜1，刘佳云2△（遵义医学院：1.药理学教研室/基础药理教育部重点实验室；2.病理生理学教研室，贵州遵义563003）

目的在局灶性脑缺血再灌注模型制备中对线栓法进行改良，以促进线栓顺利进出，提高2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色质量。方法取SPF级雄性SD大鼠60只，随机分为A组（常规栓线组）、B组（栓线加长组）和C组（栓线加长和改良TTC染色组），每组20只，制备局灶性脑缺血再灌注模型。术后比较分析三组大鼠的死亡率、栓线回缩数量、神经功能评分、拔栓线时所需时间、脑组织病理学切片及TTC染色结果。结果B、C组大鼠栓线回缩至切口发生率（均为0）低于A组［40.0%（8/20）］，再灌注耗时［（1.09±1.90）、（1.13±0.31）min］较A组［（5.57±1.90）min］明显缩短，差异均有统计学意义（P＜0.05）。术后12 h，B、C组神经功能缺损评分［（2.32±0.63）、（2.35±0.46）分］与A组［（2.42±0.50）分］比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。苏木精-伊红染色结果显示，B、C组病理组织学改变与A组相似。TTC染色结果显示，A、B两组染色后颜色分明，对比明显，C组即便用锡箔纸进行避光处理，避光染色效果仍不理想。结论延长栓线长度能简化再灌注退栓线时的操作，采用棕色安瓿瓶进行TTC染色能提高染色质量。

大鼠，Sprague-Dawley；脑/病理学；颈总动脉；脑缺血；再灌注

缺血性脑血管疾病是一类高发病率、高致死率、高致残率疾病，给社会及患者家庭带来沉重的负担。缺血后再灌注可进一步加重缺血性损伤，建立有效的脑缺血再灌注模型，对开展脑缺血再灌注损伤的研究具有重要意义。目前常采用线栓法局灶性脑缺血再灌注模型［1-4］。其具有不开颅、易把握栓塞位置，可准确控制缺血和再灌注时间、大脑中动脉闭塞效果较理想等优点，因此应用较为广泛［5］。SD大鼠为制备脑缺血再灌注模型的常用实验动物，因其脑血管解剖结构和功能与人类相近，具有价廉易得、抗感染能力强等特点而广泛应用于脑血管疾病的基础研究［6］。而现阶段的改良模型仍存在一些问题，如再灌注时栓线容易回缩至切口内，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl fourazolenitrogen chloride staining，TTC，又称红四氮唑）染色颜色不明显等。本研究结合改良模型制作的基本方法，在栓线长度和TTC染色步骤技巧等方面加以适当改进，以期简化手术过程，缩短操作时间，提高模型成功率。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，体质量250～300 g。将其随机分为A、B、C三组，每组20只。A组：常规栓线组；B组：栓线加长组；C组：栓线加长和改良TTC染色组。SD大鼠由第三军医大学大坪医院动物中心提供［SCXK（渝）2007-0005］。

1.1.2试剂及栓线准备栓线由北京沙东生物技术有限公司提供（不同体质量的SD大鼠选择不同型号的栓线，根据需要选择栓线的级别），线身直径0.26mm，头端包被多聚赖氨酸，线头直径（0.36±0.02）mm，球端相距19～20mm处有黑色标记，线长40、60mm。TTC（分析纯）由上海山浦化工有限公司提供。此外，准备60W白炽灯、磷酸盐缓冲液（PBS）、聚维酮碘、青霉素等。

1.2方法

1.2.1术前准备实验前对SD大鼠适应性喂养1周，自由饮水、进食。术前12 h禁食，自由饮水，用苦味酸做好标记。实验器械高压蒸汽法灭菌，烘干。7%水合氯醛0.5mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位固定，颈前区备皮，聚维酮碘消毒。术中用白炽灯保温。

1.2.2线栓法制备模型参照Zea Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，颈部正中切口，钝性分离皮下组织，然后再钝性分离胸骨舌骨肌和胸骨乳突肌后可见动脉鞘，分离和结扎颈总动脉（CCA），在分离CCA时动作要轻柔，以减少对迷走神经的刺激。并在CCA近心端、远心端分别穿线，近心端系紧，远心端系一松结备用。沿着CCA，到达甲状腺的位置便分为颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），在肉眼直视下可见到CCA的“Y”型分叉状结构。用尖头弯镊紧贴着“Y”形分叉处分离ECA、ICA，并在ECA穿线结扎，用微动脉夹夹闭ICA。然后用镊子柄或手指垫于CCA下，剪一“V”字型切口，插入栓线，用备用的丝线打一正结，松开ICA的动脉夹，然后调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，轻轻将线栓送入颅内，注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力或栓线标记接近CCA与ICA分叉处为止。把CCA上的丝线打一反结固定，记录栓线进入的时间，确定无活动性出血后缝合肌肉与皮肤层，缝合皮肤的过程中不能碰到栓线，且栓线的残端要留在皮肤外，肌内注射青霉素预防感染。于2 h后向外拔出栓线进行再灌注，把栓线退出至标记点露出皮肤为止，检查皮肤外的栓线，为防止出血，栓线残留应留在血管内。手术过程中注意保持大鼠体温。A组用常规栓线（栓线长度为40mm），B、C组均用加长的栓线（栓线长度为60mm）。

1.2.3神经功能缺损评分术后12 h，根据Bederson等［7］建立的5分评分法进行神经功能缺陷评分。无神经症状为0分；大鼠不能伸展缺血侧前肢，具体表现为患侧前肢不能肩内旋、肘外展、紧贴胸壁为1分；将大鼠置于地面时，推动患侧肩向对侧移动时，阻力明显降低为2分；大鼠自由行走，会在地面转圈，或行走时身体倾斜为3分；软瘫，肢体无自发性活动为4分。待大鼠清醒后进行神经功能缺陷评分，评分为1～3分，表明造模建立成功，剔除0分无症状及4分症状过重的模型大鼠。

1.2.4组织病理学观察取出大脑标本石蜡包埋、切片，常规脱蜡水化，二甲苯原液脱蜡2次，每次15min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次5min，自来水冲洗10min。苏木精染色约5min，自来水冲洗10min；盐酸乙醇分化约20 s，自来水冲洗返蓝10min；伊红染色约2min，自来水冲洗10min；逆乙醇梯度脱水，二甲苯再次透明，最后进行封片，Leica光学显微镜下观察病理学变化，并拍照记录。

1.2.5TTC染色缺血再灌注24 h后进行TTC染色。0.4%TTC母液和PBS以1∶3的比例混匀。TTC染色中需要注意避光，TTC混合液使用棕色的安瓿瓶分装（每瓶约5mL）。大鼠麻醉后剪下头部，取出脑组织，于-20℃冰冻5min左右后置于脑模具中，平均切成5片，将脑片放入棕色的安瓿瓶，将安瓿瓶横放于37℃温箱中染色30min。为防止脑片变形，使染色均匀，每隔5min进行轻微震荡。染色完毕，倒掉染色液，每瓶加入约5mL 的4%多聚甲醛于安瓿瓶内固定8 h后摄片。A、B组用棕色安瓿瓶，C组用锡箔纸包裹的透明安瓿瓶。

1.3统计学处理应用SPSS12.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，采用两独立样本t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1栓线长度对大鼠死亡情况、栓线回缩至切口及拔栓线耗时的影响三组大鼠死亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示栓线长度对大鼠死亡数量无明显影响。B、C组加长栓线长度后，栓线末端均留在切口外，无栓线回缩入切口，无需在再灌注时剪开切口缝线寻找栓线再进行缝合，B、C组大鼠栓线回缩至切口发生率低于A组，拔栓线耗时明显短于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　栓线长度对大鼠死亡情况、栓线回缩至切口及拔栓线耗时的影响

2.2各组存活大鼠神经功能缺损评分比较术后12 h，对各组存活大鼠进行神经功能评分，B、C组神经功能缺损评分［（2.32±0.63）、（2.35±0.46）分］与A组［（2.42±0.50）分］比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3各组大鼠海马CA1区病理组织学观察苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠海马神经元形态，结果显示，CA1区大部分神经细胞变性、坏死，结构不清晰，细胞质呈空泡状、细胞核出现不同程度的固缩，甚至溶解。加长栓线的B、C组病理组织学改变与A组相似。见图1。

图1　各组大鼠海马CA1区病理组织学观察（HE，400×）

2.4TTC染色A、B两组均用棕色安瓿瓶染色，染色后颜色分明，对比明显（图2A、B）。C组用透明安瓿瓶染色，即便用锡箔纸进行避光处理，避光染色效果仍不理想（图2C）。

图2　三组TTC染色效果比较

3　讨　论

线栓法已成为广大研究者制备脑缺血灶灌注模型最为青睐的方法之一［8-12］。为使模型成功率更高、更稳定，研究者对线栓法进行了诸多改进。作者在传统线栓法的基础上查阅相关文献，经反复实践并总结，对线栓法及TTC染色进行了进一步改良。

3.1大鼠的选择SD大鼠造模操作简单，出血量少［13］。选择雄性大鼠，排除雌激素对大脑的保护作用。为提高造模成功率，大鼠体质量控制在250～300 g［14］。动物饲养于SPF级动物房，为术后大鼠提供适宜的温度及湿度。

3.2栓线的选择购买成品栓线，保持规格一致，根据大鼠体质量范围选择不同型号的栓线；其次，选择栓线的级别以提高模型稳定型。

3.3切口及分离的部位切口及分离的部位沿胸锁乳突肌内侧分离肌肉筋膜，暴露CCA，在分离CCA时要动作轻柔，减少对迷走神经的刺激，沿着CCA向上分离ICA、ECA，CCA的“Y”型分叉状结构。在分离CCA分叉处时用尖头弯镊紧贴“Y”型分叉处分离，这样可以避开对CCA的“Y”型分叉神经和血管的刺激，降低大鼠的死亡率，确保模型的稳定性。

3.4插栓线插栓线要使栓线有一定程度的弯曲，保证栓线向屋顶方向弯曲进入ICA，当感到有阻力，且栓线黑色标记到达CCA分叉处时，说明栓线头端已经到达大脑中动脉起始处。最好用手来插栓线，感知栓线达到大脑中动脉时的阻力，避免栓线插入过深戳破血管引起脑出血。

3.5拔栓线2 h后进行再灌注，以栓线黑色标记退出皮肤为宜，剪短栓线残端。不能把栓线完全退出，因为易引起出血。实验结果表明，加长栓线长度，对大鼠病理学损伤和神经功能无明显影响，但能简化再灌注步骤。可以避免栓线退回切口后重新打开切口、缝合等步骤，且造模2 h后，大部分大鼠已经苏醒，再次打开切口会增加大鼠造模时的痛苦。

3.6术后大鼠的护理肌内注射抗生素避免术后感染，保持实验室温度在25℃左右，并进行分笼饲养。

3.7TTC染色采用棕色安瓿瓶可以达到良好的避光效果。安瓿瓶横放，可避免脑片变形，使脑片染色均匀。

总之，线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注的模型技术日益成熟，如何简化手术操作，降低动物的死亡率，提高模型的稳定性，仍需要科研者不断探索总结。本研究结果表明，延长栓线长度能简化再灌注退栓线时的操作。采用棕色安瓿瓶进行TTC染色能提高染色质量，值得推广借鉴。

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本刊编辑部

Study onmodified suture-occludedmethod for preparing focal cerebral ischem ic reperfusionmodel in SD rat*

Liu Bo1，LiFei1，Wang Lina1，Liu Jiayun2△（1.Teachingand Researching Section ofPharmacology/Key LaboratoryofBasic Pharmacology ofMinistryofEducation；2.Teachingand Researching Section ofPathophysiology，ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To improve the suture-occludedmethod in preparing the focal cerebral ischemia reperfusionmodel for promoting the smooth entry and exitof thread embolism and increasing 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）staining quality.Methods60 SPF grademale SD ratswere selected and randomly divided into the group A（routine suture-occluded group），B（lengthened embolic thread group）and C（lengthened embolic thread plus improved TTC staining group），20 cases in each group.The focal cerebral ischemia reperfusionmodelwas prepared.The postoperativemortality rate，number of thread embolism retraction，neural function score，needing time for pulling out thread embolism，brain tissue pathological section and TTC staining resultswere compared among 3 groups.ResultsThe occurrence rate of thread embolism retraction to incision in ythe group B and Cwas0，whichwas lower than 40.0%（8/20）in the group A；the elapsed time for reperfusion in the group B and C was（1.09±1.90）and（1.13±0.31）min respectively，whichwassignificantly shortened comparedwith（5.57±1.90）min in thegroup A，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.The neurological impairmentscoresatpostoperative 12 h in the group B and Cwere（2.32±0.63）points and（2.35±0.46）points respectively，which showed no statistical difference compared with（2.42±0.50）points in the group A（P＞0.05）.The HE staining results showed that the histopathologicalchange in the group B and Cwas similar to that in the group A.After TTC staining，the color in the group A and Bwas clearwith obvious contrast，but the effect for avoiding lightand staining in the group Cwas still undesirable，even though conducting the avoid light processing by using the silver paper.ConclusionExtending theembolic thread lengthmay simplify theoperating forwithdrawing the embolic thread in reperfusion and adopting the brown ampoules for conducting staining can improve the staining quality.

Rats，Sprague-Dawley； Brain/pathology； Carotid artery，common； Brain ischemia； Reperfusion

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.02.001

A

1009-5519（2016）02-0161-03

贵州省科学技术基金资助项目（黔科合JZ字［2014］2015号）。

刘波（1986-），硕士研究生，讲师，主要从事神经药理学方面的研究。

，E-mail：363842539@qq.com。

2015-06-30

2015-08-20）